تحليل المشابك المناعية بين الخلايا التائية البشرية وخلايا الراجي المحملة ب SEB باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 4:28 د • July 8th, 2025
خذ أنابيب قياس التدفق الخلوي التي تحتوي على خلايا راجي غير المحملة والمكورات العنقودية الذهبية السموم المعوية B أو خلايا راجي المحملة ب SEB.
تعمل خلايا الراجي المحملة ب SEB كخلايا بائية مقدمة مستضد بديل تحتوي على المستضد الفائق SEB المركب إلى جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية.
احتضان مع الكريات البيض.
ترتبط مستقبلات الخلايا التائية ، TCRs على الخلايا التائية ب SEBs على خلايا راجي ، والتي ، جنبا إلى جنب مع الإشارات التحفيزية المشتركة ، تنشئ توصلا مستقرا بين الخلية والخلية ، وهو مشبك مناعي ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا التائية.
يؤدي هذا إلى مسارات الإشارات داخل الخلايا ، مما يتسبب في إعادة ترتيب الهيكل الخلوي للأكتين ، مع تجميع جزيئات الإشارات والمستقبلات السطحية داخل المشبك.
بعد الحضانة ، قم بإصلاح الخلايا للحفاظ على هياكلها الخلوية. تخلل الخلايا للوصول إلى الأهداف داخل الخلايا.
أضف الأجسام المضادة المضادة ل CD3 المسماة بالفلوروفور ، والفالودين ، و DAPI ، والتي ترتبط ب CD3 في مركب TCR ، وخيوط الأكتين ، والحمض النووي ، على التوالي.
باستخدام مقياس تدفق التصوير الخلوي ، تصور إشارات الفلورسنت من CD3 والأكتين لتحديد إثرائها في المشبك في وجود SEB.
ابدأ بخلط مليلتر واحد من الدم المحيطي البشري المسحوب حديثا مع 30 مل من محلول تحلل ACK في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. بعد ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة ، املأ الأنبوب ب PBS لغسل الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من وسط الاستزراع لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة ، أضف 5 × 105 Staphylococcus aureus Enterotoxin B أو SEB محملة أو مفرغة من خلايا الراجي في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع في أنابيب FACS الفردية ، متبوعة ب 650 ميكرولتر من الكريات البيض عمومية. قم بتدوير الثقافات المشتركة ، وأعد تعليق الكريات في 150 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بدوامة الخلايا برفق لمدة 10 ثوان بسرعة 100 دورة في الدقيقة مع إضافة 1.5 مل من 1.5٪ بارافورمالدهايد. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أوقف التثبيت بمليلتر واحد من PBS مكملا بنسبة 1٪ BSA ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى BSA و 0.1٪ سابونين ، وأضف عينات الخلية إلى بئرين فرديين من صفيحة قاع U سعة 96 بئرا.
بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بالطرد المركزي للوحة وأعد تعليق الكريات في 50 ميكرولترا من PBS بالإضافة إلى BSA والصابونين ، التي تحتوي على الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور أو المركبات ذات الأهمية لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في 150 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى BSA والصابونين ، وأعد تعليق الكريات في 60 ميكرولتر من PBS.
لتصوير الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، افتح برنامج التحليل ، وتحقق من مستوى السائل ، وانقر فوق بدء التشغيل في قائمة الأدوات. بعد ذلك، انقر فوق تحميل، وقم بتحميل العينات في المنفذ عندما يطلب منك ذلك.
ضمن علامة التبويب Illumination ، قم بتغيير طاقة ليزر الإثارة إلى أطوال النانومتر المناسبة. بعد ذلك ، اضبط بوابات القناتين 4 و 11 ، واضبط مساحة القناة 1.
لتقييم تعديلات البوابات وطاقة الليزر ، قم بتبديل عرض القائمة إلى البوابة المعنية ، واضبط البوابات وقوى الليزر حتى تظهر الخلايا وأزواج الخلايا. بعد ذلك، في علامة التبويب "الحصول على الملفات"، حدد اسم العينة، وعدد الصور المراد الحصول عليها، والبوابة المناسبة لتلوين CD3، وانقر فوق "اكتساب" لبدء عملية الاستحواذ.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لدراسة تنشيط الخلايا التائية باستخدام خلايا Raji المحملة بـ SEB كخلايا B بديلة لتقديم المستضد. تتضمن هذه العملية استخدام قياس التدفق الخلوي لتصوير تكوين المشبك المناعي وارتباط مستقبلات الخلايا التائية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
- قياس التدفق الخلوي
خلفية علمية
- يمكن تحميل خلايا Raji بمستضدات فائقة مثل SEB.
- يتطلب تنشيط الخلايا التائية كلاً من التعرف على المستضد وإشارات التحفيز المشترك.
- تعد المشابك المناعية ضرورية لاستجابات الخلايا التائية الفعالة.
- يتيح قياس التدفق الخلوي إجراء تحليل مفصل للتفاعلات الخلوية.
الغرض من الدراسة
- لبحث آليات تنشيط الخلايا التائية.
- لتصوير تكوين المشابك المناعية.
- لتقييم دور SEB في ارتباط مستقبلات الخلايا التائية.
الطرق المستخدمة
- تحضير خلايا Raji المحملة وغير المحملة بـ SEB.
- الزراعة المشتركة لخلايا Raji مع كريات الدم البيضاء الشاملة (pan-leukocytes).
- تثبيت الخلايا ونفاذيتها من أجل صبغ الأجسام المضادة.
- تحليل قياس التدفق الخلوي لتصوير ديناميكيات TCR والأكتين.
النتائج الرئيسية
- التكوين الناجح للمشابك المناعية بين الخلايا التائية وخلايا Raji المحملة بـ SEB.
- تصوير إثراء CD3 والأكتين عند المشبك.
- توضيح مسارات إشارات تنشيط الخلايا التائية.
- التحليل الكمي لاستجابات الخلايا التائية لـ SEB.
الاستنتاجات
- تحاكي خلايا Raji المحملة بـ SEB الخلايا المقدمة للمستضد بشكل فعال.
- يعد قياس التدفق الخلوي أداة قوية لدراسة تفاعلات الخلايا التائية.
- يعد فهم ديناميكيات المشبك المناعي أمراً بالغ الأهمية للأبحاث المناعية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تمكن هذه الطريقة من التقييم الكمي لتكوين المشبك المناعي، وهو حدث مبكر وحاسم في تنشيط الخلايا التائية، مما يدعم التحقق من الأهداف في عملية اكتشاف المُعدِّلات المناعية. ومن خلال تصور إثراء CD3 والأكتين عبر قياس التدفق الخلوي التصويري، توفر هذه الطريقة تقليلًا للمخاطر الميكانيكية للمستحضرات الحيوية التي تستهدف مسارات إشارات TCR. ويعزز هذا النهج من الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية للتفاعل المناعي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء فرضيات التأشير المعتمدة على مستقبلات الخلايا التائية (TCR) من خلال التصوير المباشر لتشكل المشبك المناعي.
- القيمة العلمية: دعم التحقق الوظيفي من الأهداف عبر تأكيد تنشيط الخلايا التائية المعتمد على المستضد والمحفز المشترك.
- القيمة التشغيلية: تمكين تقليل المخاطر البيولوجية للمرشحات المعدلة مناعيًا من خلال مقاييس المشبك الكمية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير أنظمة تفاعل الخلايا التائية (T cell) مع الخلايا المقدمة للمستضد (APC) المعتمدة لعمليات فحص المركبات اللاحقة.
- القيمة التشغيلية: تقديم قراءات قياسية وقابلة للتكرار لتكوين المشابك العصبية المناعية من أجل تحسين المقايسة.
- القيمة التشغيلية: دعم استخدام منصة قابلة للتوسع في مرحلة الانتقال من المركبات الواعدة إلى المركبات الرائدة (hit-to-lead) للمعدلات المناعية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يتوافق مع الأنظمة ذات الصلة بالأمراض من خلال نمذجة التفاعلات بين الخلايا التائية والخلايا البائية البشرية في المسارات التي يحفزها المستضد الفائق.
- القيمة العلمية: يربط مرحلة الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال ديناميكيات المشبك المناعي القابلة للقياس الكمي.
- القيمة الاستراتيجية: يوجه قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال ربط الارتباط المبكر بالهدف بالاستجابات الوظيفية للخلايا التائية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتناسب هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من فحص ارتباط الهدف وصولاً إلى تحسين المركبات الرائدة، وبالأخص بالنسبة للمعدِّلات المناعية والمواد المساعدة للقاحات.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بتفاعلات TCR-pMHC والتفاعلات التحفيزية المشتركة في سياقات المناعة البشرية.
- الفحص: يوفر أنظمة جاهزة للمقايسة مع مخرجات تصوير كمية لتقييم تأثير المركبات.
- التحليلات: يوفر مقاييس إثراء CD3 والأكتين التي تتيح التحليل المقارن عبر الظروف التجريبية.
- البحث الانتقالي: يربط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال نمذجة تكوين المشبك المناعي البشري في المختبر.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: يؤسس لمنصة قياس تدفق تصويري قابلة لإعادة الاستخدام للتوصيف المناعي عبر المجالات العلاجية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي في تنشيط الخلايا التائية.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي وقابلية إعادة إنتاج قياسات المشبك المناعي عبر المختبرات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) من خلال توفير قراءات وظيفية مبكرة حول فعالية المعدلات المناعية.
- تأثير المحفظة: تتيح ترتيب أولويات المرشحين بناءً على تقييم المخاطر استناداً إلى بيانات كمية حول تشكيل المشبك.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم المناعة، وقياس التدفق الخلوي، وبروتوكولات الصبغ الفلوري.
- يعتمد على توفر أجهزة قياس التدفق الخلوي التصويرية وعناصر التحكم في التعويض للألواح متعددة الألوان.
- يستلزم توحيد معايير تحضير الخلايا وتوقيت الحضن لضمان الكشف القابل للتكرار عن المشابك.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند التوسع في استخدام الخلايا المناعية الأولية أو الخطوط الخلوية ذات الصلة بالمرض.
- يقتصر على الحاجة إلى مزارع مشتركة من الخلايا الحية وظروف تحميل مثلى لـ SEB لتحقيق نتائج متسقة.
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
فائقة الدقة التصوير من الخلايا القاتلة الطبيعية المناعية المشبك على دعم الزجاج مستو الدهن طبقة ثنائية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تحضير الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز لدراسة إنتاج الجسيمات من المشابك المناعية للخلايا التائية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تقنية الفحص المجهري للTIRF التصوير، في الوقت الحقيقي في وقت واحد من TCR وما يرتبط بها من البروتينات اشارة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تكوين المشبك المناعي بين الخلايا التائية المساعدة والخلايا العارضة للمستضد
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
استخدام الطبقات الدهنية الثنائية المدعومة بالخرز للتحقيق في الإخراج المشبكي من الخلايا التائية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تقييم الواجهة متشابك لخلايا تي البشرية الأولية من الدم والأنسجة اللمفاوية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 22 أغسطس 2026