اختبار لدراسة دور الفيترونكتين في التصاق البكتيري بالخلايا الظهارية المضيفة
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 3:53 د • July 8th, 2025
خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على طبقات أحادية للخلايا الظهارية الملتصقة. استبدل الوسائط بوسائط خالية من المصل ، مما يمنع تداخل بروتين المصل. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسائط. اغسل الخلايا بالعازلة. أضف وسائط مبردة خالية من المصل تحتوي على فيترونكتين. احتضان في درجات حرارة منخفضة.
يرتبط مجال RGD الطرفي N للفيترونكتين بمستقبلات الإنتجرين على سطح الخلية الظهارية. تمنع درجات الحرارة المنخفضة الاستيعاب الخلوي لمركب فيترونكتين - إنتجرين.
بعد تشبع مستقبلات الإنتجرين ، قم بإزالة الوسائط. يغسل بمحلول عازل لإزالة الفيترونكتين الزائد، والذي قد يؤثر على ربط الإنتجرين المعتمد على الفيترونكتين البكتيري.
أضف المستدمية النزلية من النوع f ، أو Hif ، وهو مسببات الأمراض البكتيرية سالبة الجرام ، المعلق. حضن.
يرتبط البروتين H الموجود على سطح Hif بالطرف C للفيترونكتين ، مما يسهل التصاق Hif بالخلية الظهارية والاستيعاب اللاحق.
قم بإزالة الوسائط وغسلها بمخزن مؤقت لإزالة Hif غير المقيد. استخدم إنزيم انفصال الخلايا لحصاد الخلايا. أضف وسائط تحتوي على مصل لإيقاف التفاعل الأنزيمي. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب زجاجي يحتوي على خرز زجاجي. دوامة لتحلل الخلايا ، وإطلاق البكتيريا الداخلية والمتصلة بالسطح.
خفف المحللة بوسائط خالية من السيروم وبذرة على طبق أجار الشوكولاتة. احتضن Hif لتشكيل مستعمرات. عد المستعمرات.
يشيرالعدد الأكبر من المستعمرات إلى تعزيز التصاق Hif بالخلايا الظهارية في وجود vitronectin.
ثقافة الخلايا الظهارية A549 كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد غسل واحد وتحويل التربسين للخلايا عند 37 درجة مئوية ، قم بتخفيف تعليق الخلية إلى 5,000 خلية لكل مليلتر باستخدام وسط كامل يحتوي على 5 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين.
قبل الإصابة بالعدوى البكتيرية ، استبدل الوسط الموجود في الآبار بوسط F12 واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. اغسل الخلية أحادية الطبقة ثلاث مرات باستخدام 1 مليلتر من PBS في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الطبق على الثلج وأضف 200 ميكرولتر من وسط F12 المبرد مسبقا ، والذي يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الفيترونكتين.
بعد احتضان اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ، تخلص من المحلول عن طريق سحب العينات ، واغسل طبقة الخلية مرتين باستخدام 1 مليلتر من PBS في درجة حرارة الغرفة. أضف 100 ميكرولتر من النوع البري Hif المزروع حديثا في وسط F12 إلى كل بئر. احتضان الطبق لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. ثم استنشق الوسط بماصة ، واغسل الخلايا الظهارية A549 ثلاث مرات باستخدام PBS عند 50 ميكرولتر لكل بئر من محلول انفصال الخلية واتبعه بحضانة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من F12 الوسط الكامل لكل بئر لإيقاف التفاعل الأنزيمي. انقل الخلايا الظهارية من كل بئر إلى أنبوب زجاجي سعة 6 مليلتر يحتوي على 4 حبات زجاجية. قم بعمل الخلايا في درجة حرارة الغرفة عن طريق الدوامة لمدة دقيقتين.
بعد تخفيف تحلل الخلية 100 ضعفا ، ضع 10 ميكرولتر من العينة المخففة على طبق أجار الشوكولاتة. عد المستعمرات بعد حضانة ليلية عند 37 درجة مئوية.
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في التصاق بكتيريا Haemophilus influenzae من النوع f (Hif) بالخلايا الظهارية بوساطة الفيت رونيكتين. يوضح البروتوكول خطوات تحضير طبقات أحادية من الخلايا الظهارية وتقييم الالتصاق البكتيري من خلال عد المستعمرات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأحياء الدقيقة
- بيولوجيا الخلية
- آليات العدوى
خلفية علمية
- تعد بكتيريا Haemophilus influenzae type f من الممرضات البكتيرية سالبة الجرام.
- الفيترونيكتين (Vitronectin) هو بروتين سكري يلعب دوراً في التصاق الخلايا.
- تعتبر مستقبلات الإنتغرين (Integrin) الموجودة على الخلايا الظهارية ضرورية لالتصاق البكتيريا.
- يمكن أن تؤثر درجة الحرارة على عملية استيعاب معقدات الفيترونيكتين-إنتغرين داخل الخلايا.
الغرض من الدراسة
- تقييم دور الفيت رونيكتين في تعزيز التصاق Hif بالخلايا الظهارية.
- وضع بروتوكول لقياس التصاق البكتيريا كمياً.
- فهم التفاعل بين البروتينات البكتيرية ومستقبلات خلايا المضيف.
الطرق المستخدمة
- تحضير طبقات أحادية من الخلايا الطلائية في أطباق متعددة الآبار.
- التحضين مع الفيترونيكتين (vitronectin) في درجات حرارة منخفضة لمنع الاستيعاب الداخلي.
- إصابة الخلايا بـ Hif ثم الغسل لاحقاً لإزالة البكتيريا غير المرتبطة.
- عد المستعمرات على أطباق آغار الشوكولاتة لتقييم مستويات الالتصاق.
النتائج الرئيسية
- لُوحظ زيادة في التصاق Hif بالخلايا الظهارية في وجود الفيترونيكتين.
- أدى التحكم في درجة الحرارة إلى تثبيط عملية إدخال معقد الفيترونيكتين-إنتيغرين بشكل فعال.
- أشارت أعداد المستعمرات إلى وجود ارتباط مباشر بين تركيز الفيترونيكتين والالتصاق البكتيري.
الاستنتاجات
- يعزز الفيترونيكتين (Vitronectin) بشكل كبير من التصاق Hif بالخلايا الظهارية.
- قد يساهم فهم هذا التفاعل في تطوير استراتيجيات لمكافحة العدوى البكتيرية.
- يمكن استخدام البروتوكول المعتمد في الدراسات المستقبلية حول آليات الالتصاق البكتيري.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يتيح هذا المقايسة التقييم الكمي للتفاعلات بين المضيف والممرض عن طريق قياس التصاق البكتيريا بالخلايا الظهارية عبر الآليات التي يتوسطها الفيترونيكتين. كما أنها تدعم التحقق من الأهداف في اكتشاف مضادات العدوى من خلال تقليل المخاطر المتعلقة بالفرضيات الميكانيكية حول مسارات الالتصاق. توفر هذه الطريقة ثقة تنبؤية لتحديد أولويات المركبات أو المواد البيولوجية التي تعطل الارتباط بين المضيف والممرض.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يستقصي الفرضية العلاجية بأن الفيترونكتين يعزز التصاق المسببات المرضية البكتيرية بخلايا المضيف.
- القيمة التشغيلية: يوضح دور مستقبلات الإنترغرين في المضيف في مسارات استيعاب المسببات المرضية داخلياً.
- القيمة العلمية: يدعم التحقق من صحة الهدف الوظيفي من خلال ربط ارتباط الفيترونكتين بالإنترغرين بكفاءة الاستعمار البكتيري.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير نماذج معيارية للخلايا الظهارية لإجراء تقييم قابل للتكرار للالتصاق البكتيري.
- القيمة التشغيلية: تتيح الحصول على قراءات كمية لوحدات تكوين المستعمرات من أجل فحص مثبطات الالتصاق.
- القيمة العلمية: تسهل إمكانية توسيع نطاق المقايسة من خلال تحديد تركيز الـ vitronectin وخطوات التحضين التي يتم التحكم في درجة حرارتها.
الأبحاث الانتقالية والسريرية الأولية
- القيمة العلمية: يستخدم خلايا A549 الظهارية ذات الصلة بالمرض لنمذجة التفاعلات مع المسببات المرضية التنفسية.
- القيمة التشغيلية: يوفر الاستمرارية من مرحلة الارتباط بالهدف إلى نتائج الالتصاق الوظيفي في النماذج قبل السريرية.
- القيمة العلمية: يدعم التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال قياس انخفاض الالتصاق كعلامة حيوية لنشاط مضادات الضراوة.
تكامل مسار العمل ومنظومة التشغيل
يندرج هذا المقايسة ضمن مرحلة الاكتشاف المبكر، حيث تساهم في تحديد المركبات الرائدة من خلال قياس التفاعلات بين الممرض والمضيف التي يتوسطها الهدف قبل إجراء اختبارات الفعالية قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: اختبار الفرضيات الميكانيكية حول دور الفيترونيكتين في تسهيل التصاق البكتيريا واستيعابها داخلياً.
- الفحص: تقديم بيانات كمية وقابلة للتكرار عن الالتصاق عبر عدّ الوحدات المكونة للمستعمرات (CFU) لمقارنة ظروف التثبيط.
- التحليلات: إنتاج قراءات لعدد المستعمرات تتيح المقارنة الإحصائية لمستويات الالتصاق عبر المجموعات التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: ربط آليات الالتصاق الجزيئي بالاستمرارية قبل السريرية باستخدام نماذج ظهارية ذات صلة سريرياً.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: إنشاء منصة قابلة لإعادة الاستخدام لدراسة مسببات الأمراض المتنوعة التي تستغل بروتينات المصفوفة خارج الخلوية للمضيف من أجل الالتصاق.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال تقليل الغموض في آليات التصاق المضيف والممرض.
- القيمة التشغيلية: توحيد تقييم الالتصاق من خلال تحديد جرعات الفيترونيكتين، والتحكم في درجة الحرارة، وخطوات الغسل.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف عن طريق تحديد المركبات التي تمنع الالتصاق بوساطة الضراوة في مرحلة مبكرة من الاكتشاف.
- تأثير المحفظة: تمكين تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للعلاجات المضادة للالتصاق بناءً على بيانات كمية لتثبيط الالتصاق.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في صيانة المزارع الخلوية والتعامل مع المسببات المرضية تحت ظروف السلامة البيولوجية.
- تعتمد على توفر أجهزة قراءة الأطباق متعددة الآبار، وأجهزة الطرد المركزي، وحاضنات لاهوائية أو حاضنات CO2 لنمو البكتيريا.
- تستوجب توحيد مصدر وتركيز الفيترونكتين عبر المختبرات لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.
- تتضمن اعتبارات التكيف عند توسيع نطاق المقايسة لتشمل أنواع الخلايا الظهارية أو البطانية غير التنفسية.
- تشمل قيوداً عملية مثل التباين المحتمل في تعبير عوامل الضراوة البكتيرية، مما يؤثر على قراءات الالتصاق.
الأسئلة الشائعة حول الصيدلة الحيوية
Opsono- الالتزام بـ اختبار لتقييم الأجسام المضادة الوظيفية في تطوير اللقاح ضد عصيات الجمرة الخبيثة وغيرها من مسببات الأمراض المغلفة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تقييم الاستجابات المناعية التنفسية للمستدمية النزلية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الكشف الآلي عالي الإنتاجية عن الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
نموذج الأمعاء في المختبر لتقييم التصاق البكتيريا واستبطانها
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
طريقة قائمة على ELISA لتحليل التفاعلات بين بروتينات الطعم والفريسة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تحديد دور الفيترونكتين في مقاومة البكتيريا للنشاط المبيد للجراثيم في المصل البشري
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
مقايسة العدوى البكتيرية لدراسة تفاعلات البكتيريا اللاهوائية بين الخلايا المضيفة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فحص الالتصاق في المختبر للكشف عن التصاق الخلايا السرطانية بمصائد العدلات خارج الخلية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 22 أغسطس 2026