توليد جزيئات شبيهة بفيروس الشيكونغونيا باستخدام نظام التعبير عن الفيروس العصبي في خلايا الحشرات

الجسيمات الشبيهة بفيروس الشيكونغونيا ، VLPs ، هي هياكل غير معدية تتكون من بروتينات غلاف فيروسية مدمجة داخل طبقة ثنائية دهنية ، وخالية من المواد الوراثية.

لإنتاج Chikungunya VLPs ، قم بإصابة خلايا حشرات Spodoptera frugiperda Sf9 بفيروسات الباكولو المؤتلفة التي تعبر عن كاسيت جيني هيكلي من Chikungunya. يتكون الكاسيت من محفز لفيروس باكولو، مدمج مع جينات تشيكونغونيا الهيكلية التي تشفر القفيصة وبروتينات الغلاف.

أثناء الحضانة ، ترتبط البروتينات السكرية لغلاف الفيروس العصبي بالمستقبلات السطحية على خلايا الحشرات. هذا يسهل دخول الفيروس العصعصبي وإطلاقه في السيتوبلازم ، مما ينتج عنه بروتينات متعددة تحتوي على قفيصة الشيكونغونيا وبروتينات الغلاف.

ينتج عن الانقسام التحفيزي الذاتي لبروتين القفيصة السلائف التي تمتلك بروتينات مغلفة في الشبكة الإندوبلازمية ، ER. في تجويف ER ، تشق الإنزيمات السلائف متعددة البروتينات ، وتولد بروتينات فردية تدخل حجرة جولجي لمزيد من المعالجة ، وتشكل البروتين غير المتجانس.

تشق البروتياز المقيم في جولجي البروتين غير المتجانس ، وتنتج بروتينات مغلف ناضجة مع بروتينات E2 و E1. تنتقل بروتينات الغلاف هذه إلى الغشاء ، وتتبرعم في VLPs وتنطلق في الوسط.

انقل المزرعة المصابة إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي لحبيبات خلايا الحشرات. قم بشفط المادة الطافية المحتوية على VLP وقم بتصفيته لإزالة الحطام.

المرشح الناتج ، الذي يحتوي على chikungunya VLPs ، جاهز لدراسات علم الأمراض المناعية.

الثقافة مسبقا Spodoptera frugiperda ، أو خلايا Sf9 ، في تعليق في قوارير دوارة عن طريق التقليب المستمر عند 130 دورة في الدقيقة على نظام لوحة تحريك متعدد النقاط. حافظ على أحجام المزرعة بما لا يزيد عن نصف حجم قارورة الدوار للتهوية المناسبة. بعد ذلك ، عبر عن CHIK VLPs عن طريق إصابة 250 مل من خلايا Sf9 في قارورة دوارة بكثافة 2 × 10⁶ خلايا لكل مليلتر مع فيروس باكوتشي مؤتلف معد مسبقا ، وإعادة الخلايا إلى حاضنة 28 درجة مئوية.

استخدم استبعاد التريبان الأزرق لتحديد ما إذا كانت صلاحية الخلية قد انخفضت إلى 70٪ إلى 80٪. عند التأكيد ، انقل الثقافات مباشرة من التعليق إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر ، وقم بتدوير الخلايا لأسفل. اجمع المواد الطافية ، وقم بتصفيتها من خلال غشاء مسام 0.22 ميكرون قبل الترسيب.