الفحص المجهري داخل الحيوية لتحليل التفاعلات بين خلايا الدم والبطانة في نموذج فأر التهابي

ابدأ بفأر مخدر تم حقنه داخل الصفاق بعديدات السكاريد الدهنية للحث على الالتهاب.

شق البطن لكشف تجويف البطن. حافظ على ترطيب الأعضاء بالمحلول الملحي. حقن الرودامين 6G الرجعية المدارية. تدخل جزيئات الصبغة الفلورية إلى الدورة الدموية وتضع علامة على الكريات البيض والصفائح الدموية لتصورها.

الآن ، قم بإخراج حلقة من الدقاق بأوعية المساريق. حافظ على ترطيب الأنسجة بمحلول ملحي مسخن مسبقا للحصول على تصوير مثالي. تحت المجهر الفلوري ، ركز على الوريد المساريق للفحص المجهري داخل الحيوية.

يتسبب حقن عديد السكاريد الدهني في تنشيط الخلايا البطانية مع تنظيم جزيئات الالتصاق ، بما في ذلك الاختيارات. يتم تجنيد الصفائح الدموية المنتشرة في البطانة ، حيث ترتبط عبر تفاعلات محددة بين جزيء الالتصاق والترابط ، وتشكل مجمعات الالتصاق.

بسبب هذه التفاعلات ، يتم تنشيط الصفائح الدموية وتطلق حبيبات تحتوي على جزيئات ، بما في ذلك السيروتونين ، مما يعزز تجنيد الكريات البيض.

تنتقل الكريات البيض إلى السطح البطاني وترتبط بالصفائح الدموية المنشطة. علاوة على ذلك ، تتدحرج الكريات البيض على طول البطانة وترتبط بالخلايا البطانية من خلال تفاعلات لاصقة ضعيفة. تعمل الحركة المتدحرجة على تنشيط إنتجرينات الكريات البيض من أجل الالتصاق القوي بالخلايا البطانية ، وهو أمر بالغ الأهمية لانتقال الكريات البيض وبطانة.

باستخدام الفحص المجهري داخل الحيوية ، تصور الكريات البيض الفلورية والصفائح الدموية لتحديد تفاعلاتها في الوقت الفعلي مع الخلايا البطانية.

قبل أربع ساعات من التصوير داخل الحيوية ، قم بحقن 20 ملليغرام لكل كيلوغرام من LPS IP في فأر ذكر يبلغ من العمر 16 إلى 20 جراما من 4 إلى 6 أسابيع للحث على الاستجابة الالتهابية البكتيرية الوهمية.

قم بتسخين محلول ملحي بنسبة 0.9٪ مسبقا في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لترطيب الغرفة البلاستيكية وأنسجة المساريق في هذا الوقت أيضا. بعد ذلك ، تأكد من عمق التخدير المناسب من خلال عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم في الفأر المعالج ب LPS ، ثم ضع المرهم على عيون.

قم بإزالة البطن باستخدام ماكينة حلاقة ، وإزالة أي شعر فضفاض بشاش مبلل بالإيثانول بنسبة 70٪. ثم استخدم ملقطا صغيرا منحنيا ومقصا لفتح البطن.

تحديد الأوعية الشرسوفية ، وافتح الصفاق في منطقة الخط ألبا لحماية الأوعية. ضع بضع قطرات من المحلول الملحي الدافئ مسبقا في تجويف البطن للحفاظ على رطوبة الأنسجة ، متبوعا بحقن مداري رجعي من 50 ميكرولتر من الرودامين 6G لتسمية خلايا الدم المنتشرة. بعد ذلك ، ضع الفأر في طبق بتري بطول 10 سم ، وقم بإخراج حلقة من الدقاق ، وقم بإدارة المحلول الملحي المسخن مسبقا كل دقيقتين للحفاظ على رطوبة الأنسجة.

لتصور الاستجابة الالتهابية عن طريق الفحص المجهري داخل الحيوية ، ضع الفأر تحت المجهر وأحضر وريدا مساريقيا بقطر 200 إلى 300 ميكرومتر وأقل قدر ممكن من الدهون المحيطة المرئية في مجال الرؤية.

باستخدام برنامج المجهر المناسب ، قم بتسجيل تفاعلات خلايا الدم البطانية لمدة دقيقة واحدة في 4 عروق مختلفة لكل فأر. بعد ذلك ، لتحليل الاستجابات من خلية إلى خلية ، تأكد من ظروف تدفق الدم المستقرة والفردية.

لتحديد عدد الكريات البيض المتدحرجة ، ارسم خطا رأسيا عبر الوريد ، واحسب يدويا جميع الكريات البيض التي تعبر هذا الخط في 1 دقيقة. لتحديد سرعة التدحرج ، ارسم خطين رأسيين عبر الوريد على بعد 50 ميكرومتر ، وقم بقياس الوقت الذي تستغرقه كريات الدم البيضاء الواحدة للعبور بين الخطوط أثناء التدحرج بثبات على البطانة.

لقياس التصاق الكريات البيض ، ارسم مربعا 200 × 200 ميكرومتر في الوريد. ثم قم بحساب الكريات البيض الملتصقة بقوة يدويا والتي لا تظهر أي حركة مرئية داخل المربع لمدة 30 ثانية. أخيرا ، لتحديد تفاعلات الصفائح الدموية والكريات البيض ، احسب يدويا عدد الصفائح الدموية المرتبطة بكريات البيض الواحدة.