تقنية لإنشاء نموذج عدوى بكتيرية في يرقات الحشرات

ضع يرقة Galleria mellonella - عثة الشمع الأكبر - على منصة حقن ، مما يؤدي إلى تعريض الجانب البطني.

خذ محقنة دقيقة تحتوي على معلق من المتفطرة بوفيس BCG lux - سلالة لقاح بكتيرية حية معدلة وراثيا لإنتاج تلألؤ بيولوجي. حقن المعلق في الجزء الأمامي الأخير، أو الزوائد البطنية — إطلاق البكتيريا في الهيموليمف — السائل الدوري في تجويف الجسم.

انقل اليرقة إلى بيئة خاضعة للرقابة واحتضنها. تستخدم البكتيريا الهيموليمف كمصدر غني بالعناصر الغذائية وتتكاثر.

تتجمع الخلايا الدموية - الخلايا المناعية اللافقارية في الهيموليمف - حول البكتيريا ، وتشكل بنية تشبه الورم الحبيبي لمنع انتشار العدوى. تطلق الخلايا الدموية مؤيدة الفينولوكسيداز ، والتي تخضع لانقسام محلل البروتين لتكوين فينولوكسيداز.

يصنع الفينولوكسيديز الميلانين الذي يعزل البكتيريا في موقع العدوى. يؤدي ترسب صبغة الميلانين إلى الميلانين الجهازي ، وتغميق لون اليرقات.

تبتلع الخلايا الدموية البكتيريا في البلعمة. تندمج البلعمات مع الجسيمات الحالة للحصول على إنزيمات محللة ، مما يتسبب في تدهور البكتيريا. يمكن لمجموعة فرعية من البكتيريا أن تتهرب من تدهور البلعمة وتعيش في الخلايا الدموية - مما يؤدي إلى عدوى مستمرة.

قياس التلألؤ البيولوجي البكتيري على فترات محددة. يشير الانخفاض الأولي في التلألؤ البيولوجي إلى استجابة فعالة مضادة للبكتيريا ، بينما يشير استقرار القيمة إلى عدوى مستمرة.

حافظ على يرقات الطور المشتراة في الظلام عند 18 درجة مئوية عند الوصول واستخدمها في غضون أسبوع واحد من الشراء. تحديد واختيار اليرقات السليمة للتجريب بناء على لون الكريم الموحد ، والحجم والوزن المناسبين ، والحركة العالية ، وامتلاك القدرة على تصحيح نفسها عند قلبها. باستخدام ملاقط غير حادة ، عد اليرقات السليمة بعناية في طبق بتري مبطن بطبقة من ورق الترشيح ، واحفظها في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى الاستخدام.

قم بإعداد منصة الحقن عن طريق لصق ورق ترشيح دائري بقطر 94 ملم على سطح مستو ومرتفع. قم بشفط ثلاثة أحجام من الإيثانول بنسبة 70٪ في حقنة دقيقة سعة 25 ميكرولتر لتعقيمها والتخلص منها وشطفها بثلاثة أحجام من PBST المعقمة. بعد ذلك ، قم بتعليق لقاح BCG lux المحضر ، واستنشق 10 ميكرولتر في المحقنة المجهرية المعقمة. استخدم حقنة منفصلة لشفط PBST للحصول على تحكم سلبي.

بعد 10 حقن ، قم بتعليق لقاح BCG lux لضمان تعليق خلوي موحد. استخدم الملقط لالتقاط يرقة واحدة ووضعها على منصة الحقن. على المنصة ، اقلب اليرقة على ظهرها وقم بتثبيت الشلل عن طريق تثبيت الرأس والذيل بالملاقط. حدد موقع آخر مقدمة يسرى تقوم بالعد التنازلي من رأس اليرقة وأدخل بعناية طرف الإبرة بعمق 5 إلى 6 مم بزاوية 10 إلى 20 درجة إلى المستوى الأفقي. حقن اللقاح من المحقنة.

بعد كل إصابة ، انقل اليرقة المصابة إلى طبق بتري مبطن بطبقة من ورق الترشيح. يمكن أن يستوعب طبق بتري واحد مقاس 94 ملم ما يصل إلى 30 يرقة. قم بتخزين طبق بتري في صندوق مظلم مجيد التهوية داخل حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

راقب بقاء اليرقات كل 24 ساعة. تعتبر اليرقات ميتة عندما تفشل في التحرك استجابة للمس. سجل البقاء على قيد الحياة وقم بتقييم الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار Mantel-Cox.