قياس العبء في الجسم الحي للبكتيريا التي تعبر عن اللوسيفيراز في يرقة الحشرات

لقياس العبء البكتيري في الجسم الحي ، ابدأ بيرقات الحشرات المعقمة المصابة مسبقا بعصيات كالميت غيرين ، أو BCG lux. BCG lux عبارة عن سلالة متفطرة بوفيس BCG معدلة وراثيا تعبر عن لوسيفيراز - إنزيم منتج للتلألؤ الحيوي.

انقل يرقة الحشرات إلى أنبوب مصفوفة للتحلل يحتوي على عازلة مع كرات فولاذية. باستخدام الخالط ، قم بتجانس اليرقة ، وإطلاق المكونات داخل الخلايا ، بما في ذلك البكتيريا ، في المخزن المؤقت.

جهاز الطرد المركزي للأنبوب لجمع التجانس ونقله إلى أنبوب مقياس الإضواع.

اغسل أنبوب المصفوفة بمحلول احتواء يحتوي على المنظفات لإذابة الشظايا الخلوية وإطلاق البكتيريا المتبقية.

اجمع الكسور في نفس أنبوب مقياس الإضاءة وأضف ركيزة لوسيفيراز. تدخل الركائز في البكتيريا وتتفاعل مع إنزيمات لوسيفيراز ، مما يؤدي إلى تلألؤ بيولوجي. قم بتحميل الأنبوب في مقياس الإضاءة وقياس التلألؤ الحيوي.

يقيس مقياس الإضاءة شدة الضوء المنبعث ويحسب وحدة الضوء النسبي ، أو RLU - مما يدل على عبء BCG في الجسم الحي في يرقة الحشرات.

انشر المعلق المتجانس المخفف على صفيحة أجار تحتوي على بيبيراسيلين واحتضنه لتنمو BCG بشكل انتقائي كمستعمرات متميزة. تمثل المستعمرات الموجودة على اللوحة وحدة تشكيل المستعمرة ، أو CFU. تربط نسبة RLU إلى CFU التلألؤ البيولوجي بقابلية البكتيريا للبقاء.

كل 24 ساعة ، اختر بشكل عشوائي خمس يرقات مصابة ، واستخدم مسحة من براعم القطن مبللة ب 70٪ من الإيثانول لتعقيم أسطح اليرقات برفق. ضع اليرقات بشكل فردي في أنابيب مصفوفة للحليل سعة ملليلتر تحتوي على 800 ميكرولتر من PBS المعقمة. بعد ذلك ، استخدم الخالط لتجانس اليرقات لمدة 60 ثانية بسرعة ستة أمتار في الثانية.

قم

بالطرد المركزي لأنابيب الغسيل عند 3,500 مرة جم لمدة خمس ثوان لإزالة الجانس من الأغطية ، وصب الجانس بعناية في خمسة أنابيب معقمة لمقياس الإضاءة بشكل فردي. احتفظ ب 100 ميكرولتر من الجانسات في أنبوب تفاعل معقم سعة 1.5 ملليلتر. استرجع أي متجانس متبقي عن طريق غسل أنابيب مصفوفة المحلول بملليلتر واحد من PBST ، والماصة في أنابيب مقياس الإضاءة المقابلة.

دوامة أنابيب مقياس الإضاءة ، وقياس التلألؤ البيولوجي للمجانسات على مقياس الإضواء. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف من 100 ميكرولتر من الجانسات المحجوزة في ألواح استزراع 24 بئرا باستخدام PBST. ماصة 10 ميكرولتر من التخفيف على كل صفيحة أجار Middlebrook 7H11 ، واستخدم موزعة صفيحة معقمة للنشر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين.

بعد ذلك ، عد وحدات تشكيل المستعمرة.