$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
لتحديد كمية تسلل الخلايا المناعية في أنسجة المثانة الفئرانية المصابة بالإشريكية القولونية المسببة للمسالك البولية ، ضع الأنسجة المفرومة في مخزن مؤقت للهضم يحتوي على الكولاجيناز والديوكسيربونوكلياز.
احتضان مع الرج المنتظم لتعطيل الأنسجة.
يهضم الكولاجيناز المصفوفة خارج الخلية للأنسجة ، ويطلق الخلايا. يحلل منقوص الأكسجين نوكلياز الحمض النووي الحر المتداخل.
بعد الحضانة ، أضف عازلة بعامل مخلب ومصل بقري للجنين لتعطيل الإنزيمات الهضمية.
مرر الخليط المهضوم عبر مصفاة لإزالة بقايا الأنسجة والأنسجة الضامة ، والحصول على تعليق أحادي الخلية.
جهاز الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت يحتوي على أجسام مضادة تحجب Fc. ترتبط هذه الأجسام المضادة بمستقبلات Fc للخلايا المناعية لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.
أضف الأجسام المضادة المضادة ل CD45 الموسومة بالفلوروفور ، والتي ترتبط ببروتين CD45 عبر الغشاء على الخلايا المناعية.
جهاز طرد مركزي وتمرير الخلايا المعلقة عبر مصفاة خلية لإزالة مجاميع الخلايا.
باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، قم بقياس إشارات التألق من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور على الخلايا المناعية لتحديد كمية تسلل الخلايا المناعية في المثانة.
لإجراء قياس التدفق الخلوي على أنسجة المثانة ، بعد عزل المثانة كما هو موضح ، استخدم المقص لفرم الأنسجة جيدا. أضف 1 مثانة مفرومة لكل أنبوب يحتوي على عازلة هضم ، ثم رج الأنبوب لغسل الأنسجة المفرومة في عازلة الهضم ، واحتفظ بها على الثلج حتى يتم تشريح جميع المثانات وفرمها. احتضن المثانة المفرومة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 إلى 75 دقيقة مع هز قوي باليد لمدة 5 ثوان كل 15 دقيقة.
عندما يكون للأنسجة مظهر زجاجي وشفاف يشبه المناديل الورقية المبللة ، يكتمل الهضم. قم بتعطيل إنزيمات الهضم عن طريق إضافة 2 إلى 3 ملليلتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي المثلج ، واخلطه برفق. ثم ضع الأنابيب على الجليد.
لضمان تعليق أحادي الخلية وإزالة أي نسيج ضام ، قم بتمرير محتويات الأنبوب عبر مرشح 100 ميكرومتر يوضع في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ثم ، بنهاية مكبس المحقنة ، اضغط برفق على أي أنسجة متبقية من خلال الفلتر. اغسل الفلتر بسعة 2 مل إضافية من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي ، واحتفظ بالعينات على الجليد. ثم اغسل العينات بالطرد المركزي عند 200 مرة جم في 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق.
أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي الذي يحتوي على كتلة Fc مخففة إلى 5 ميكروغرام لكل مليلتر ونقلها إلى لوحة مستديرة القاع سعة 96 بئر. بعد 10 إلى 15 دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المطلوب إلى كل عينة. ثم احتضان العينات على الجليد ، المحمية من الضوء ، لمدة 30 إلى 45 دقيقة. اغسل العينات بالطرد المركزي عند 200 مرة جم في 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق.
أخيرا ، قم بإعادة تعليق كريات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي ، وقم بتمرير العينات عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر على أنبوب بوليسترين سعة 5 ملليلتر قبل الاستحواذ على مقياس التدفق الخلوي.