نظام مراسل الفيروسات المؤتلف في المختبر للكشف عن العدوى الفيروسية
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 3:56 د • July 8th, 2025
خذ مزرعة خلايا سرطان الكبد البشري المعدلة وراثيا للتعبير عن بولي ببتيد التوروكولات الصوديوم أو NTCP - مستقبل عبر الغشاء.
أضف فيروس التهاب الكبد B المؤتلف أو فيروس التهاب الكبد B يتكون الفيروس من غلاف خارجي يحتوي على بروتينات سطحية ونيوكليوكابسيد داخلي يحيط بالجينوم. يمنع إدخال جين مراسل لوسيفيراز القدرة الإنجابية للفيروس.
يرتبط بروتين الغلاف الفيروسي بمستقبل NTCP للخلية المضيفة.
يتفاعل NTCP مع مستقبلات عامل نمو البشرة ، EGFR ، وقلة القلة ، مما يؤدي إلى الالتقام الخلوي للفيروس بوساطة EGFR.
يندمج الغلاف الفيروسي مع الغشاء الداخلي لإطلاق النوكليوكابسيد ، الذي يتفكك في مركب المسام النووية.
يدخل الجينوم الفيروسي إلى النواة ويتحول إلى DNA دائري مغلق تساهميا أو cccDNA - قالب مستقر - يشفر البروتينات الفيروسية ، بما في ذلك لوسيفيراز.
على فترات محددة مسبقا ، قم بحصاد الخلايا والليز لإطلاق لوسيفيراز داخل الخلايا.
تقديم ركيزة المراسل. يؤكسد لوسيفيراز الركيزة ، مما ينتج عنه إشارة.
تشيرالزيادة بعد الإصابة في نشاط لوسيفيراز إلى التعبير المستمر عن الجينوم الفيروسي.
خلايا لوحة HepG2 ، تعبر بثبات عن توروكولات الصوديوم ، أو بولي ببتيد النقل المشترك ، أو NTCP المعرضة للإصابة بعدوى فيروس التهاب الكبد B ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
قبل يوم واحد من الإصابة ، قم بوضع ما يقرب من 5 × 104 خلايا HepG2 / NTCP في آبار صفيحة مطلية بالكولاجين مكونة من 96 بئرا في 0.1 مل من وسط الاستزراع. قم بإذابة فيروس الورم الحليمي البشري المؤتلف في حمام مائي 37 درجة مئوية ، حتى يتبقى القليل من الثلج في القارورة.
قم بإعداد وسيط للعدوى عن طريق الجمع بين 78 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج ، وميكرولترين من DMSO ، و 10 ميكرولتر من 40٪ PEG8000 في 1X PBS ، و 10 ميكرولتر من فيروس الورم الحليمي البشري المؤتلف. أضف 100 ميكرولتر من محلول HBV المؤتلف إلى كل بئر من لوح 96 بئرا.
بعد يوم واحد من الإصابة ، استخدم 300 ميكرولتر من PBS لغسل الخلية ثلاث مرات ، لإزالة بروتين المراسل الملوث من جزء الفيروس. أضف 200 ميكرولتر من وسط الثقافة الذي يحتوي على 2٪ DMSO إلى الخلايا المصابة ، واحتضن لمدة أسبوع أو أقل.
لإجراء تحليل لعدوى فيروس التهاب الكبد B ، بعد أسبوع واحد من الإصابة ، استخدم PBS لغسل الخلايا المصابة ثلاث مرات. أضف 50 ميكرولترا من محلول التحلل إلى الخلايا المصابة. هز لوحة الثقافة لمدة خمس دقائق ، ثم جهاز الطرد المركزي بمعدل 2000 مرة جم لمدة خمس دقائق. أضف 50 ميكرولترا من ركيزة المراسل إلى لوحة مقياس الإضاءة ، ثم أضف 20 ميكرولترا من محللة الخلية إلى اللوحة ، واخلطها عن طريق الرج لفترة وجيزة. أخيرا ، ضع اللوحة في مقياس الإضاءة وابدأ القراءة.
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في آلية عدوى فيروس التهاب الكبد B (HBV) في خلايا سرطان الكبد البشرية المعدلة وراثياً للتعبير عن الببتيد المتعدد ناقل الصوديوم توروكولات (NTCP). ويسلط البحث الضوء على دور NTCP في تسهيل دخول HBV والتعبير اللاحق عن البروتينات الفيروسية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الفيروسات
- بيولوجيا الخلية
- علم الأورام
خلفية علمية
- يعتبر فيروس التهاب الكبد B مصدر قلق صحي عالمي كبير.
- يعد NTCP مستقبلًا يتوسط دخول HBV إلى خلايا الكبد.
- يمكن أن يساعد فهم آليات عدوى HBV في تطوير استراتيجيات علاجية.
- تُستخدم مقاييس لوسيفيراز المراسّة لقياس النشاط الفيروسي.
الغرض من الدراسة
- توضيح دور NTCP في عدوى HBV.
- تقييم تعبير الجينوم الفيروسي بعد العدوى.
- تطوير طريقة موثوقة لدراسة HBV في المختبر (in vitro).
الطرق المستخدمة
- زراعة خلايا HepG2 التي تعبر عن NTCP.
- العدوى بفيروس HBV مأشوب يحتوي على جين مراسل للـ luciferase.
- تحلل الخلايا وقياس نشاط الـ luciferase.
- استخدام PBS ومحلول التحلل (lysis buffer) لمعالجة الخلايا.
النتائج الرئيسية
- نجاح إصابة خلايا HepG2/NTCP بفيروس HBV.
- يشير زيادة نشاط اللوسيفيراز (luciferase) إلى استمرار التعبير عن الجينوم الفيروسي.
- يسهل تفاعل NTCP مع HBV دخول الفيروس إلى الخلايا المضيفة.
- توفر مقاييس اللوسيفيراز قياساً كمياً لإصابة HBV.
الاستنتاجات
- يعد NTCP ضرورياً لدخول HBV إلى خلايا الكبد.
- تعتبر فحوصات مراسل اللوسيفيريز فعالة لدراسة ديناميكيات HBV.
- يمكن استخدام هذا النموذج في أبحاث HBV المستقبلية واختبار الأدوية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح الكشف الكمي عن عدوى فيروس التهاب الكبد B (HBV) باستخدام نظام مراسل لوسيفيريز مأشوب القياس الدقيق لأحداث دخول الفيروس وتكاثره المبكرة في خلايا الكبد البشرية. وتدعم هذه القدرة الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في مسارات اكتشاف مضادات الفيروسات. ويوفر هذا النظام منصة قابلة للتطوير والتكرار لتقييم التفاعلات بين HBV والمضيف وفحص التدخلات المرشحة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصناعات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء المباشر لآليات دخول HBV عبر الارتباط بمستقبل NTCP.
- يدعم التحقق الوظيفي من التفاعلات بين المضيف والفيروس والتي تعد حاسمة للاستهداف العلاجي.
- يسهل الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال عزل أحداث العدوى المبكرة عن التضاعف اللاحق.
- يوفر قراءات كمية لتحديد أولويات الأهداف بناءً على الفرضيات.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر مقايسة خلوية موثقة وقابلة للتكرار للكشف عن عدوى HBV.
- يولد إشارات لوسيفيريز كمية وقوية مناسبة للفحص عالي الإنتاجية.
- يوحد قياس العدوى، مما يتيح تقييماً موثوقاً للمركبات وقابلية نقل المقايسة.
- يدعم القابلية للتوسع لفحص مكتبات المركبات التي تستهدف دخول الفيروس أو تكاثره.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يوائم ديناميكيات العدوى في المختبر مع نماذج الخلايا المضيفة ذات الصلة بالمرض.
- يتيح الاستمرارية من الاكتشاف الميكانيكي إلى التحقق قبل السريري من المرشحات المضادة للفيروسات.
- يوفر منصة لتقييم المؤشرات الحيوية الانتقالية لعدوى HBV عند دعمها بنقاط نهاية إضافية.
- يقلل من المخاطر البيولوجية من خلال توضيح التفاعلات المبكرة بين الفيروس والمضيف.
تكامل خط المعالجة وسير العمل
يدمج نظام مراسل الفيروس المؤتلف هذا بين مرحلتي الاكتشاف المبكر وتحديد المركبات الرائدة، مما يدعم كلًا من الدراسات الميكانيكية وسير عمل الفحص في أبحاث HBV.
- بيولوجيا الاكتشاف: تعمل على قياس دخول الفيروس وتضاعفه المبكر كمياً، مما يوضح مسارات العدوى التي يتوسطها NTCP.
- الفحص: توفر قراءات معيارية وقابلة للتكرار تعتمد على لوسيفيراز لتقييم المركبات.
- التحليلات: تتيح قياساً كمياً وحساساً لحركية العدوى ومقارنات الظروف.
- الأبحاث الانتقالية: تدعم الاستمرارية في المرحلة قبل السريرية من خلال نمذجة العدوى في خلايا مشتقة من الكبد البشري.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر منصة قابلة لإعادة الاستخدام والتكييف لمختلف احتياجات أبحاث HBV وفحوصات مضادات الفيروسات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف والفهم الميكانيكي لعدوى HBV.
- القيمة التشغيلية: تعزز توحيد المقايسات، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع لفرق البحث والتطوير.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن عملية اتخاذ قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) وتقلل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة ضمن محافظ الأدوية المضادة للفيروسات.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للأصول التي تستهدف HBV والنهوض بالمرشحات الدوائية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا، والتعامل مع الفيروسات، والمقاييس القائمة على التألق الحيوي.
- يستلزم إمكانية الوصول إلى خلايا HepG2 التي تعبّر عن NTCP وفيروس HBV مراسل مؤتلف.
- يتطلب أجهزة معيارية للكشف عن إشارة اللوسيفيريز وتحليل البيانات.
- يعد التنسيق بين الفرق بشأن بروتوكولات المقايسة وتفسير البيانات أمراً ضرورياً لضمان إمكانية تكرار النتائج.
- قد يتطلب التكيف مع أنظمة فيروسية أخرى عمليات تحقق وتحسين إضافية.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية البيولوجية
في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي القائم علي الفحص التشخيصي لدراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة Poxvirus
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيروس أنفلونزا مراسل لوسيفيراز الفلورسنت للتصوير الحي والقياس الكمي للعدوى الفيروسية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عالية الإنتاجية المضادة للفيروسات المقايسات لفحص لمثبطات تكرار فيروس زيكا
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيروس الإنفلونزا لوسيفيراز الفلورسنت لتتبع العدوى الفيروسية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
يعيش خلية تصوير TGF-β/Smad3 مما يشير إلى المسار في المختبر و في فيفو باستخدام نظام مراسل إتش
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 29 أغسطس 2026