التصوير في الوقت الحقيقي لكثرة البلعمة الضامة لخلايا الدم الحمراء IgG

خذ شريحة قناة تحتوي على ضامة الماوس. تتصل القناة بالخزانات المملوءة بالوسائط ، مما يوفر العناصر الغذائية للضامة.

استبدل الوسائط بأجسام مضادة تحتوي على الوسائط ذات علامات الفلورسنت ، والتي ترتبط ببروتينات سكرية سطحية معينة ، مع وضع علامات على الضامة.

خذ خلايا الدم الحمراء البشرية ، كرات الدم الحمراء ، مع أغشية الخلايا المصنفة بالفلورسنت. قم بمعالجة كرات الدم الحمراء بالأجسام المضادة IgG للفأر ، والتي ترتبط على وجه التحديد بالجليكوفورين A.

أضف كرات الدم الحمراء المعاكسة IgG إلى الشريحة المحتوية على البلاعم. تربط مستقبلات Fc في البلاعم منطقة Fc من IgGs على كرات الدم الحمراء ، مما يؤدي إلى تجميع مستقبلات Fc حول منطقة التلامس وتمييز كرات الدم الحمراء للبلعمة.

يؤدي

الربط إلى تشغيل مسارات الإشارات داخل الخلايا وتنشيط GTPases. تعمل GTPases المنشطة على إعادة تنظيم الأكتين والبلمرة ، وتشكيل نتوءات غشائية رقيقة تسمى filopodia.

علاوة على ذلك ، تمتد filopodia حول كرات الدم الحمراء ، وتحيط بها داخل الكأس البلعمية النامية. تندمج حواف الكوب ، وتشكل البلعمة التي تستوعب كرات الدم الحمراء المضادة للتحلل.

باستخدام المجهر متحد البؤر ، احصل على صور بفاصل زمني لأحداث البلعمة الفردية.

لتسمية البلاعم البريتونية ، استبدل وسط البيكربونات في كل شريحة قناة بوسط كامل مكمل ب HEPES ، وقم بإمالة الشريحة للسماح بإضافة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الخاص بالبلاعم الماوس ذي العلامات الفلورية ذات الأهمية إلى فتحة قناة 100 ميكرولتر للشريحة. استنشق الوسط الذي يتدفق إلى خزان المصب ، واحتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية في حالة عدم وجود ثاني أكسيد الكربون.

أثناء وضع العلامات على الخلايا البريتونية ، امزج برفق عينة من 4 إلى 2000 من خلايا الدم الحمراء ، وانقل 400 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 2 مليلتر في كتلة من الألومنيوم ساخن داخل غطاء تدفق رقائقي لمدة 5 إلى 8 دقائق.

عندما ترتفع درجة حرارة الخلايا إلى 37 درجة مئوية ، امزج 0.4 ميكرولتر من بقعة غشاء البلازما الفلورية الحمراء المناسبة مع الخلايا ، ثم ضع الخلايا مرة أخرى في الكتلة الحرارية. بعد 5 دقائق ، اغسل الخلايا بإضافة 1.6 مل من الوسط الكامل الطازج المكمل ب HEPES وأجهزة الطرد المركزي. قم بتدوير الأنبوب لتحديد حبيبات خلايا الدم الحمراء.

باستخدام طرف ماصة من 1 إلى 1.5 ملليلتر ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية في مجلدين دون إزعاج الحبيبات. بعد ذلك ، امزج 2,000 ميكرولتر من الوسط الكامل الطازج المكمل ب HEPES مع الخلايا. جهاز طرد مركزي وإعادة تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من المتوسط. بعد ذلك ، قم بتسمية الأنبوب PMS لصبغة غشاء البلازما. في نهاية حضانة وضع العلامات على الخلايا البريتونية لمدة 20 دقيقة ، اغسل الشريحة ب 1 ملليلتر من الوسط الطازج الكامل المكمل ب HEPES.

لمعالجة خلايا الدم الحمراء ، أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد CD235a أحادي النسيلة المضاد للإنسان IgG2b إلى أنبوب عينة الدورة الشهرية. بعد 8 دقائق عند 37 درجة مئوية مع الخلط مرة واحدة في الدقيقة ، انقل 100 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء البشرية الملطخة بغشاء البلازما ، IgG ، إلى شريحة القناة المحتوية على البلاعم البريتوني. بمجرد إضافة خلايا الدم الحمراء البشرية ، قم بتركيب الشريحة على مجهر متحد البؤر على قرص دوار مع ضبط حاضنة المرحلة على 37 درجة مئوية ، وابدأ على الفور في تصوير الخلايا.