JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 2:53 د • July 8th, 2025
للبدء ، خذ أنبوبا يحتوي على خلايا سرطانية في وسط خال من المصل لتقليل تداخل إسترازاز المصل أثناء الفحص. احتضن بصبغة الكالسين AM غير الفلورية.
تعمل الاستيرازات النشطة داخل الخلايا على تحلل الكالسين AM إلى صبغة كالسين الفلورية غير المنفذة للغشاء والتي يتم الاحتفاظ بها في السيتوبلازم.
الخلايا السرطانية الملطخة بالكالسين والخلايا الطبيعية المستجيبة في آبار الاختبار ، بينما تحتوي آبار التحكم فقط على خلايا سرطانية ملطخة بالكالسين بدون خلايا NK.
ترتبط مستقبلات سطح الخلية المنشطة للخلايا القاتلة الطبيعية بتنشيط الروابط على الخلايا السرطانية ، وتشكيل مشبك مناعي. ينشط هذا الارتباط إشارات الخلايا القاتلة الطبيعية ، مما يؤدي إلى استقطاب الحبيبات السامة للخلايا التي تحتوي على البيرفورينات والجرانزيم باتجاه المشبك لإطلاقها.
تشكل البرفورينات مسام غشاء الخلايا السرطانية ، مما يسهل الدخول الخلوي للجرانزيم ويبدأ موت الخلايا المبرمج. تتسبب سلامة الغشاء المعرضة للخطر في تسرب الكالسين الفلوري ، مما يقلل من تألق الخلايا السرطانية.
التقط صورا مضان للآبار.
يشير انخفاض عدد الخلايا السرطانية الحية الفلورية في الآبار المحتوية على الخلايا القاتلة الطبيعية مقارنة بآبار التحكم إلى السمية الخلوية بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية تجاه الخلايا السرطانية.
لتقييم السمية الخلوية بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام الكالسيوم AM ، بعد زراعة خلايا خط خلايا سرطان الكبد البشري إلى التقاء 70٪ إلى 80٪ ، كما هو موضح ، قم بإعادة تعليق الخلايا في 3 ملليلتر من DMEM الخالي من المصل ، وقم بتسمية الخلايا ب 1.5 ميكرولتر من محلول الكالسيوم AM 10 ملليمولار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 5 ملليلتر من PBS لكل غسلة.
أعد تعليق الخلايا عند 1 × 105 خلايا لكل مليلتر من تركيز وسط المزرعة ، وأضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا في ثلاث نسخ لكل حالة معالجة. بعد ذلك ، أضف 1 × 105 خلايا NK بشرية في 100 ميكرولتر من وسط المزرعة إلى كل بئر من الخلايا المستهدفة ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة أربع ساعات.
بعد نهاية الحضانة ، التقط ما لا يقل عن 10 حقول مختلفة من الصور للخلايا الإيجابية للكالسيوم AM لكل تكرار لكل حالة علاج على مجهر مضان بتكبير 10 مرات. ثم احسب النسبة المئوية للسمية الخلوية باستخدام الصيغة.