فحص السمية الخلوية لسلالات المكورات العنقودية الذهبية على العدلات بعد البلعمة

تناول سلالات المكورات العنقودية الذهبية الخبيثة والأقل ضراوة.

أضف المصل لتقوية البكتيريا.

نقل التركيزات البكتيرية المتزايدة إلى آبار الصفائح متعددة الآبار المبردة التي تحتوي على العدلات. تمنع درجات الحرارة المنخفضة تنشيط العدلات.

أجهزة الطرد المركزي لتسهيل البلعمة المتزامنة.

تربط مستقبلات العدلات الأوبسونين ، مما يؤدي إلى استيعاب البكتيريا في البلعمة.

في البكتيريا الخبيثة ، تؤدي البيئة البلعمية إلى التعبير عن السموم المحللة للخلايا.

تشكل هذه السموم مساما ، مما يعطل البلعمة ويعرض سلامة غشاء العدلات للخطر.

ومع ذلك ، فإن البكتيريا الأقل ضراوة تظهر تعبيرا منخفضا عن السموم المحللة للخليات.

بعد الحضانة ، افصل العدلات وانقلها إلى أنابيب مقياس التدفق الخلوي التي تحتوي على صبغة يوديد بروبيديوم الفلورية (PI).

تدخل

الصبغة إلى العدلات بأغشية مخترقة وتلطخ الحمض النووي.

باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، قم بتحليل العدلات لتلوين PI.

تشير الزيادة المعتمدة على التركيز في نسبة العدلات الإيجابية PI بعد البلعمة للسلالة الخبيثة ، مقارنة بالسلالة الأقل ضراوة ، إلى السمية الخلوية للسلالة الخبيثة ضد العدلات.

عندما يصل المكورات العنقودية الذهبية المستزرعة إلى منتصف النمو الأسي ، انقل 1 مليلتر من البكتيريا المستزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي عند 5000 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل المكورات العنقودية الذهبية عن طريق شفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات ، وأعد تعليق البكتيريا المحببة في 1 مليلتر DPBS. دوامة العينات لمدة 30 ثانية. الطرد المركزي للعينات على وزن 5000 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لمعالجة المكورات العنقودية الذهبية ، أولا ، قم بإعادة تعليق الحبيبات البكتيرية في 1 مليلتر من مصل بشري بنسبة 20٪. ثم احتضان العينات عند 37 درجة مئوية مع التحريض لمدة 15 دقيقة. اغسل المكورات العنقودية الذهبية بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح سابقا. خفف سلالات المكورات العنقودية الذهبية إلى 1 × 10⁸ وحدات تشكيل مستعمرة ، CFUs لكل مليلتر ، مع RPMI مثلج. دوامة العينة لمدة 30 ثانية ، وضعها على الجليد.

تأكد من تركيزات المكورات العنقودية الذهبية المستخدمة في هذه المقايسات عن طريق طلاء 1 إلى 10 تخفيفات متسلسلة من البكتيريا على أجار. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من كل سلالة من سلالات المكورات العنقودية الذهبية ، أو RPMI ، للتحكم الإيجابي والسلبي في PMNs في صفيحة مكونة من 96 بئرا على الجليد من الخطوة 1.14. صفيحة صخرية برفق لتوزيع المكورات العنقودية الذهبية في الآبار.

قم بمزامنة البلعمة عن طريق لوحة الطرد المركزي عند 500 جم لمدة ثماني دقائق عند 4 درجات مئوية ، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية ، مباشرة بعد الطرد المركزي كوقت 0. في النقاط الزمنية المطلوبة ، ضع اللوحة على الجليد ، وأضف 200 ميكرولتر من DPBS المثلج الذي يحتوي على 1 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم إلى كل أنبوب قياس التدفق الخلوي ، ثم انقل العينات إلى الأنبوب المقابل لها.