موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 4:46 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بلوحة متعددة الآبار تحتوي على ضامة مشتقة من نخاع العظام على أغطية.
عالج البلاعم باستخدام ليشمانيا البروماستيجوت — المرحلة المعدية للطفيلي.
أثناء الحضانة ، تتفاعل الطفيليات مع الضامة ، مما يسهل تجميع F-actin حول موقع التفاعل.
تبتلع البلاعم الطفيليات في البلعمات المحاطة بالأكتين F ، وتشكل فجوات طفيلية أو PVs - مكانة تكاثرية.
داخل PVs ، تطلق الطفيليات عوامل البقاء على قيد الحياة ، مما يزيد من تراكم F-actin حول الفجوات وتمنع اندماجها مع الجسيمات الحالة.
بالإضافة إلى ذلك، تعمل الطفيليات على تنظيم إنتاج الهيبسيدين — وهو هرمون ببتيد بلامفاج، مما يثبط إفراز الحديد ويرفع مستويات الحديد داخل الخلايا.
يعزز تدفق الحديد إلى الفجوات تمايز البروماستيجوت إلى مسببة للأمراض ويسهل تكاثرها ، مما يعزز الفوعة.
بعد الحضانة ، اغسل لإزالة الطفيليات الحرة ، ثم قم بإصلاح البلاعم المصابة ونفاذها.
أدخل صبغة فلورية من الحمض النووي لتلطيخ نوى البلاعم والمصابات المصابة.
تحت المجهر الفلوري ، تؤكد النوى الصغيرة المتجمعة حول النواة الكبيرة للبلاعم وجود طفيليات داخل الخلايا ، مما يدل على ضراوة الليشمانيا.
في اليوم السابع أو الثامن بعد الزراعة ، استخدم طرف شفط مثبت على خط تفريغ لنقل أربعة أغطية زجاجية معقمة بالأوتوكلاف مقاس 12 ملم إلى قاع كل بئر من صفيحة ثقافة مكونة من ستة آبار دون تداخل. قم بإعداد لوحات متطابقة لكل نقطة زمنية من التجربة. بعد ذلك ، اغسل مزارع البلاعم المشتقة من نخاع العظام مرتين باستخدام 37 درجة مئوية PBS طازجة وخمسة ملليلتر من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، مع استكمال EDTA واحد لكل لوحة.
بعد خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، قم بتجميع الخلايا المنفصلة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، واشطف كل طبق مرتين بخمسة ملليلتر إضافي من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق البلاعم في خمسة إلى 10 مل من وسط البلاعم الطازج المشتق من نخاع العظام على الجليد. بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى 5 × 105 لكل تركيز مليلتر في وسط البلاعم المشتق من نخاع العظام الطازج وأضف ملليلترين من الخلايا لكل بئر إلى الصفيحة المكونة من 6 آبار. ثم احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا.
لإصابة الخلايا ب L amazonensis ، قم بتخفيف تعليق الطفيلي إلى التعدد التجريبي المناسب للعدوى ، وأضف 50 إلى 100 ميكرولتر من الطفيليات إلى كل بئر من جميع الألواح المكونة من ستة آبار ، بما في ذلك جميع النقاط الزمنية للتجربة. احتضان الضامة المشتقة من نخاع العظام لفترة العدوى ودرجة الحرارة المناسبة.
بعد ذلك ، اغسل الآبار ثلاث مرات بملليلترين من 37 درجة مئوية PBS الطازجة بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم لكل بئر ، وقم بإصلاح عينات النقطة الزمنية الأولية ب 1.5 إلى 2 مل من 2٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق. بالنسبة للألواح المقابلة للنقاط الزمنية اللاحقة ، أضف 2 مل من وسط البلاعم الطازج المشتق من نخاع العظام إلى كل بئر ، وأعد الألواح إلى الحاضنة المناسبة. بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا وغسلها لكل نقطة زمنية متبقية كما هو موضح للتو ، وقم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية في PBS الطازج.
لتلطيخ الخلايا ب DAPI ، استبدل المادة الطافية ب 1.5 مل من PBS الطازج بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، مع استكمال 0.1٪ منظف غير أيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بثلاث غسلات سعة 2 ملليلتر مع PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا بميكروغرامين لكل مليلتر من DAPI في 1 مليلتر من PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث غسلات ، ضع الغطاء على جانب الخلية لأسفل على شرائح مجهر زجاجي فردية مثبتة بكاشف تثبيت مضاد للبهتان متوفر تجاريا.
بعد ذلك ، لتحديد عدد الخلايا المصابة ، استخدم هدف زيت الغمر 100x لمجهر التألق ، وعداد إيمانويل لتحديد عدد نوى amastigote الأصغر المتجمعة حول كل نواة بلاعم كبيرة ملطخة ب DAPI.