مقايسة العدوى البكتيرية لدراسة تفاعلات البكتيريا اللاهوائية بين الخلايا المضيفة

ابدأ بثقافة الخلايا البطانية.

استبدل الوسائط بوسائط لاهوائية. احتضان في غرفة لاهوائية لتحقيق التوازن في درجة الحرارة.

أضف Porphyromonas gingivalis ، وهي بكتيريا لاهوائية مسببة للأمراض ، واحتضنها لفترة وجيزة.

تمتلك البكتيريا إسقاطات بروتينية ، تعرف باسم fimbriae ، والتي ترتبط بجزيئات التصاق معينة على الخلايا البطانية ، مما يسهل التصاق البكتيريا.

يؤدي هذا الارتباط إلى شلالات إشارات داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى إعادة ترتيب الهيكل الخلوي للأكتين واستيعاب البكتيريا في البلعمة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسائط. يغسل بمحلول لاهوائي لإزالة البكتيريا خارج الخلية غير الملتصقة.

أضف منظفا معتدلا لاختراق أغشية الخلايا المضيفة وتحفيز تحلل الخلايا ، وإطلاق البكتيريا الداخلية والمرتبطة بالسطح دون التسبب في ضرر.

تمييع البكتيريا المحتوية على المحللة بالوسائط وإعداد التخفيفات التسلسلية.

ضع هذه التخفيفات على ألواح أجار الدم. احتضان في ظل ظروف لاهوائية للسماح ل Porphyromonas gingivalis بالتكاثر وتشكيل مستعمرات.

بعد الحضانة ، قم بحساب وحدات تكوين المستعمرة (CFUs) على كل لوحة لتحديد البكتيريا المرتبطة بالسطح والداخلية ، مما يشير إلى تفاعلات الخلايا المضيفة للبكتيريا.

للاستزراع والتجريب مع Porphyromonas gingivalis ، يتم الحفاظ على غرفة الفينيل اللاهوائية مع جو اصطناعي يحتوي على 80٪ نيتروجين و 10٪ هيدروجين و 10٪ ثاني أكسيد الكربون.

ضع 30 صفيحة أجار الدم ، و 500 مل من PBS ، ومليلتر من عامل النمو البطاني الوعائي ، أو وسط VEGF ، داخل الغرفة اللاهوائية قبل 24 ساعة لموازنة الكواشف.

البذور 4 مرات 10 إلى 5 خلايا بطانية للوريد السري البشري ، أو HUVECs ، لكل بئر في ألواح من ستة آبار في وسط VEGF واتركها في حاضنة زراعة الخلايا طوال الليل للتعلق. قم بإعداد مزارع Porphyromonas gingivalis في تسريب الدماغ والقلب ، أو وسط BHI ، كما هو موضح في النص المصاحب ، والسماح للثقافات بالوصول إلى مرحلة السجل بينما تتراوح الكثافة البصرية للثقافة عند 660 نانومتر بين 0.5 إلى 0.7.

انقل البكتيريا إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ولف قطعة من البارافيلم حول الغطاء لمنع التعرض للتمارين الرياضية. ثم ، قم بالطرد المركزي للبكتيريا عند 5,000 مرة جم لمدة 10 دقائق. داخل الغرفة اللاهوائية ، اغسل البكتيريا المحببة باستخدام PBS اللاهوائي ، ثم قم بالدوران مرة أخرى عند 5,000 مرة جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق البكتيريا في وسط VEGF.

لإصابة HUVECs ب Porphyromonas gingivalis ، انقل الألواح المكونة من ستة آبار من الحاضنة إلى الغرفة اللاهوائية. استنشق الوسط من آبار الاختبار ، واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS اللاهوائية.

حدد رقم الخلية من ممثل واحد بئر عن طريق مقايسة استبعاد trypan blue. ثم أضف 2 ملليلتر لكل بئر من وسط VEGF اللاهوائي وضع الصفائح عند 37 درجة مئوية في الحاضنة اللاهوائية لمدة 20 دقيقة للتوازن.

تحديد الكثافة البصرية للبكتيريا وإعادة تعليقها في حجم مناسب من وسط VEGF لإصابة الخلايا بعدوى متعددة تبلغ 100 إلى 1 نسبة بكتيريا إلى خلايا. أضف المعلق البكتيري إلى الخلايا واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية للعدوى. لتحلل الخلايا ، داخل الغرفة اللاهوائية ، قم بإعداد وزن 1٪ لكل حجم محلول سابونين في وسط BHI ، وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرون.

لدراسة التفاعلات البكتيرية مع الخلايا المضيفة ، قم بإزالة الصفيحة المكونة من ستة آبار من الحاضنة وشفط وسط العدوى. يغسل ثلاث مرات باستخدام PBS اللاهوائية. ثم أضف 2 مل من محلول الصابونين إلى كل بئر واحتضنه لمدة 15 دقيقة للسماح بتحلل الخلايا.

بعد ذلك ، اكشط الخلايا من قاع البئر ، وقم بتخفيف محللة الخلية من 1 إلى 1 بوسط BHI. ثم قم بعمل تخفيفات تسلسلية تبدأ من 1 إلى 100. لوحة 200 ميكرولتر من التخفيف المناسب على ألواح أجار الدم. لف الصفائح بالبارافيلم ، واحتضنها في حاضنة لاهوائية 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام للسماح بتكوين المستعمرة. ثم ، باستخدام صندوق ضوئي ، احسب وحدات تشكيل المستعمرة ، أو CFUs على كل لوحة.