$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ابدأ بتعليق Porphyromonas gingivalis ، البكتيريا المسببة للأمراض اللاهوائية.
أضف BCECF-AM ، وهي صبغة غير فلورية ونفاذة للخلايا.
تعمل
الاستيرازات السيتوبلازمية النشطة على تحلل الصبغة إلى شكل فلوري غير منفذ للخلايا ، مما يؤدي إلى تلطيخ البكتيريا.
الطرد المركزي. أعد تعليق البكتيريا في الوسائط اللاهوائية.
أضف البكتيريا المصنفة إلى آبار الصفائح متعددة الآبار التي تحتوي على أغطية مع خلايا بطانة بشرية ملتصقة.
احتضان في غرفة لاهوائية.
يرتبط الفيمبريا البكتيرية بمستقبلات سطح الخلية البطانية ، مما يؤدي إلى شلالات الإشارات داخل الخلايا.
هذا يؤدي إلى إعادة ترتيب الأكتين واستيعاب البكتيريا داخل البلعمة.
بعد الحضانة ، اغسل أغطية الغطاء بمخزن مؤقت لإزالة البكتيريا غير الداخلية.
قم بإصلاح الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد للحفاظ على الهياكل الخلوية. قم باختراق الخلايا بمنظف غير أيوني للوصول إلى الأهداف داخل الخلايا.
أضف الفالودين المسمى بالفلورسنت ، والذي يرتبط بخيوط الأكتين.
ضع الغطاء فوق وسط تثبيت يحتوي على DAPI ، مما يؤدي إلى تلطيخ الحمض النووي.
لاحظ البورفيروموناس اللثة الفلورية داخل الخلايا البطانية مع الأكتين الفلوري ، مما يؤكد استيعاب البكتيريا.
لتصور البكتيريا الداخلية ، أولا ، قم أولا بنقل الأغطية الزجاجية المعقمة داخل كل بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا. لوحة خمسة أضعاف 10 إلى أربعة HUVECs لكل بئر على الغطاء ، واحتضانها لمدة 24 ساعة. لتسمية البكتيريا ، قم بالطرد المركزي بالبكتيريا في منتصف الطور ، وأعد تعليق الحبيبات باستخدام PBS اللاهوائية. جهاز طرد مركزي مرة أخرى ، وكرر خطوة الغسيل.
أضف 20 ميكرولترا من 0.2 ملليمولار BCECF-AM إلى ملليلترين من PBS اللاهوائية التي تحتوي على خمسة إلى سبعة أضعاف 10 إلى البكتيريا الثامنة لكل مليلتر. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
يمكن
للصبغة الفلورية التي نستخدمها أن تلطخ معظم البكتيريا اللاهوائية. وبالتالي ، لا يلزم وجود كواشف أخرى ، مثل جسم مضاد معين.
قم
بالطرد المركزي للتعليق البكتيري عند 5,000 مرة جم لمدة 10 دقائق لإزالة كاشف الملصقات غير المرتبط ، وإعادة تعليق البكتيريا في وسط VEGF. بعد ذلك ، قم بإصابة خلايا HUVEC بنسبة 100 إلى 1 ، والبكتيريا إلى الخلايا ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة وسط العدوى ، واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم أضف 4٪ بارافورمالدهايد ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لإصلاح الخلايا في الغرفة اللاهوائية.
قم بإزالة الخلايا الثابتة من الغرفة ، ثم اغسل الغطاء باستخدام PBS ثلاث مرات. احتضان الغطاء في مليلتر واحد من 0.2٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق لاختراق الخلايا. ثم اغسل الغطاء باستخدام PBS ثلاث مرات. الآن ، أضف 50 ميكرولترا من 50 ميكروغراما لكل مليلتر من TRITC phalloidin إلى كل غطاء ، واحتضن لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ الأكتين قليل القلة الخلوي.
بعد الحضانة ، اغسل الغطاء باستخدام PBS ثلاث مرات. اقلب الغطاء على شريحة زجاجية مع وسط تثبيت ناعم يحتوي على ميكروغرام واحد لكل مليلتر DAPI للتلوين النووي. بعد ذلك ، قم بإغلاق محيط الغطاء بطلاء الأظافر ، وراقب تحت الفحص المجهري متحد البؤر.