تقييم نشاط قتل الخلايا الفقية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

ابدأ بلوحة متعددة الآبار تحتوي على تعليق المكورات العقدية الرئوية.

إدخال الأجسام المضادة التي تستهدف مستضدات السطح البكتيري ، والتي تتفاعل مع المستضدات السطحية البكتيرية. هذا يغطي البكتيريا بالأجسام المضادة ، ويشكل بكتيريا مضادة للتعرف على المناعة.

قم بزرع الآبار بالعدلات المشتقة من الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي للإنسان المكملة بمصل الأرانب الذي يحتوي على بروتينات تكميلية.

أثناء الحضانة ، تترسب البروتينات التكميلية مثل C3b على سطح البكتيريا ، مما يؤدي إلى طلاء أوبسونين إضافي على البكتيريا المضادة للأجسام المضادة - مما يعزز التعرف على البكتيريا بواسطة العدلات.

تتفاعل المستقبلات السطحية المحددة على العدلات مع الأوبسونين على البكتيريا ، مما يسهل ابتلاع البكتيريا من خلال البلعمة.

داخل البلعمة ، تعمل العدلات على تحلل البكتيريا المبتلعة ، مما يقلل من عدد البكتيريا في المخزن العازل.

بعد الحضانة ، حدد محلول الزراعة المشتركة المخفف على صفيحة أجار الدم للسماح للبكتيريا الفردية بتكوين مستعمرات.

قارن عدد المستعمرات في البكتيريا المعالجة بالأوبسونين بالبكتيريا غير المعالجة.

يشير عدد أقل من المستعمرات مع علاج الأوبسونين إلى قتل بكتيري أعلى ، مما يشير إلى قتل ناجح للخلايا البلعمة.

قم بإذابة أنبوب واحد من المخزون البكتيري. بكتيريا الحبيبات في 6,000 مرات جم لمدة دقيقتين, وإعادة تعليق حبيبات الخلية في OBB عند التخفيف الأمثل الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة. ماصة 10 ميكرولتر من التخفيف البكتيري المعلق لكل بئر في صفيحة استزراع خلية مستديرة القاع 96 بئر. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من الجسم المضاد المناسب أو العلاج الدوائي إلى كل بئر تجريبي في نسختين.

بالنسبة لآبار التحكم ، استخدم 1X PBS أو OBB ، اعتمادا على المخزن المؤقت المستخدم لآبار المعالجة. رج لوحة العينة عند حوالي 90 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

لحصاد الخلايا المتمايزة HL60 التي تمت معالجتها ب DMF قبل ثلاثة أيام ، قم بحبيبات الخلايا بمعدل 500 مرة جم لمدة ثلاث دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات بما لا يقل عن 10 ملليلتر من 1XPBS. بيليه الخلايا المغسولة في 500 مرات غرام لمدة ثلاث دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في OBB.

أضف مصل الأرانب الصغير المعقم غير المخفف بحجم نهائي من واحد إلى خمسة. بعد مزرعة بكتيرية لمدة ساعة واحدة ، قسم كل عينة إلى آبار مكررة لمجموعتين. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من الخليط التكميلي HL60 إلى كل مجموعة تجريبية من الآبار و 50 ميكرولترا من OBB إلى آبار البكتيريا فقط. رج الطبق المكون من 96 بئرا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

لطلاء العينات ، قم بتخفيف كل بئر باستخدام OBB بحجم نهائي من واحد إلى خمسة بحيث يكون حجم كل عينة لا يقل عن 50 ميكرولترا. بعد ذلك، قم بوضع 50 ميكرولترا من كل عينة مباشرة على منطقة معينة من لوحة الاستزراع البكتيرية، مما يضمن التباعد الكافي بين العينات. قم بتغطيتها واتركها تجف لمدة 15 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.

اقلب الصفائح والثقافة طوال الليل عند 30 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، لوحات الثقافة في الجرار اللاهوائية ، لاختبار ما إذا كانت ظروف نقص الأكسجين تؤثر على نمو البكتيريا أو للتحكم في التشكل. بعد الثقافة الليلية ، قم بحساب المستعمرات في كل منطقة عينة معينة وانتقل إلى تحليل البيانات من خلال مقارنة عدد الخلايا الحية في كل مجموعة بعناصر التحكم المقابلة.

من

المحتمل أن تكون أصعب جوانب إنشاء هذه التقنية لأول مرة هي تحسين CFUs الأولية للمخزون البكتيري ، بالإضافة إلى ضمان تمييز خلايا HL60 بشكل فعال.