تلطيخ قياس التدفق الخلوي للمجموعات السكانية الفرعية المصابة بالبلاعم المصابة بالمتفطرة السلية

ابدأ بمجموعات سكانية فرعية من البلاعم M1 و M2 الملتصقة ، والتي تتميز بعلامات سطحها المحددة. هذه الخلايا مصابة بالمتفطرة السلية المسماة بالفلورسنت.

أضف مخزن FACS إلى آبار الاستزراع.

يتيح

EDTA في المخزن المؤقت انفصال الخلية عن آبار الاستزراع.

نقل تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.

الطرد المركزي الأنابيب. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في كوكتيل الأجسام المضادة المضادة للبلاعم المترافق بالفلوروكروم وصبغة البقاء ، Zombie-UV.

تدخل

صبغة مضان Zombie-UV الخلايا الميتة من خلال الأغشية التالفة وترتبط بالبروتينات السيتوبلازمية ، مما يتيح التمايز الواضح عن الخلايا غير الملوثة القابلة للحياة.

علاوة على ذلك ، ترتبط الأجسام المضادة المضادة للبلاعم المترافقة بالفلورسنت بالمستضدات المستهدفة على البلاعم ، مما يتيح الكشف التفاضلي عن المجموعات السكانية الفرعية.

اغسل الخلايا لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت مثبت للبروتينات المتقاطعة ، والحفاظ على مورفولوجيا الخلية ، وتعطيل البكتيريا الفطرية للتعامل الآمن أثناء التحليل.

أخيرا ، جهاز الطرد المركزي ومعالجة العينات لقياس التدفق الخلوي.

استخدم استراتيجية بوابات مناسبة لتحديد النسبة المئوية للمجموعات السكانية الفرعية المصابة بالمتفطرة.

لتلطيخ الخلايا لقياس التدفق الخلوي ، احتضان الخلايا المصابة ب 1 مليلتر من المخزن المؤقت FACS المكمل ب 0.5 ملليمولار EDTA لكل بئر لمدة 30 دقيقة على الأقل. في نهاية الحضانة ، اجمع الخلايا المنفصلة بسحب لطيف ، وانقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية مغطاة ببرغي للطرد المركزي.

أعد تعليق الخلايا في حوالي 50 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة للإنسان المترافق بالفلوروكروم وصبغة الجدوى ذات الأهمية ، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

بعد الغسيل ، قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من مخزن التثبيت المعد حديثا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. بعد التثبيت والغسيل ، قم بتعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من عازلة FACS ، وانقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1 ملليلتر.

لتحليل الخلايا ، استخدم حبات التعويض لتعويض إشارة الفلورسنت لكل جسم مضاد مترافق بالفلوروكروم في الكوكتيل ، واستخدم الخلايا غير الملوثة لضبط البوابة لمجموعة الخلايا السالبة. بعد ذلك ، احصل على ما لا يقل عن 50,000 خلية لكل عينة.