اختبار في المختبر لدراسة القدرة السامة للخلايا للخلايا القاتلة التي يسببها السيتوكينات

خذ مزرعة الخلايا السرطانية ببروتينات السيتوبلازمية المصنفة بالفلورسنت.

أضف الخلايا القاتلة التي يسببها السيتوكين أو خلايا CIK — الخلايا التائية المستجيبة ذات الخصائص الطبيعية الشبيهة بالخلايا القاتلة — التي تمتلك نشاطا مضادا للورم.

ترتبط مستقبلات

المجموعة القاتلة الطبيعية 2 D أو NKG2D على خلايا CIK بالبروتينات المحفزة للإجهاد على الخلايا السرطانية.

يحفز الارتباط خلايا CIK على إطلاق سموم حبيبات السيتوبلازمية - البيرفورين والجرانزيم.

تشكل البرفورينات مساما في غشاء الخلية السرطانية ، مما يسمح بدخول الجرانزيم ، التي تنشط الكاسبيس ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج.

بعد الحضانة ، حصاد الخلايا. أضف صبغة صلاحية الخلية المرتبطة بالحمض النووي الفلوري.

تدخل الصبغة من خلال غشاء الخلية التالف وترتبط بالحمض النووي ، مما ينتج عنه خلايا ميتة مزدوجة التلغين.

مع غشاء الخلية السليم ، تكون الخلايا الحية غير منفذة للصبغة.

مرر الخلايا عبر مقياس التدفق الخلوي للكشف عن الخلايا الحية التي تعرض مضان واحد وخلايا ميتة ذات مضان مزدوج.

قم بإنشاء مخطط مبعثر لقياس النسبة المئوية للخلايا السرطانية الميتة ، وتحديد التأثير السام للخلايا لخلايا CIK.

لإجراء الفحص السام للخلايا ، قم بالزراعة المشتركة ل CIK وخلايا سرطان الدم النخاعي المزمن البشرية K562 ، عن طريق إضافة 1 مليلتر من خلايا K562 إلى كل بئر في صفيحة مكونة من 6 آبار بكثافة 0.5 مليون خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من الوسط القاعدي مع أو بدون خلايا CIK إلى اللوحة المكونة من 6 آبار ، كما هو موضح في بروتوكول النص. امزج معلقات الخلية عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات على الأقل.

ضع الطبق في الحاضنة لمدة 24 ساعة. الآن ، قم بالزراعة المشتركة لخلايا CIK و OC-3 المبيضية عن طريق إضافة 1 مليلتر من الوسط القاعدي مع أو بدون خلايا CIK إلى لوحة 6 آبار ، كما هو موضح في بروتوكول النص. امزج معلقات الخلية عن طريق الماصة برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات على الأقل باستخدام الشفرة في الحاضنة لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، قم بحصاد معلق الخلية CIK-K562 مباشرة في أنبوب معقم سعة 15 ملليلترا.

لحصاد كل من الخلايا المعلقة والخلايا الملتصقة من مجموعات CIK-OC-3 ، أولا ، قم بنقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم سعة 15 مل. اغسل البئر ب 1 ملليلتر من PBS المعقم. اجمع PBS وأضفه إلى الأنبوب. ثم أضف 0.5 مل من محلول إنزيم تفكك الخلايا ، واحتضنه لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

أضف 1 مليلتر من المحلول من نفس الأنبوب إلى البئر المقابل ، واخلط الخلايا برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 ملليلتر. اجمع كل الخلايا في نفس الأنبوب. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق. استنشاق المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مليلتر من PBS المعقم. حبيبات الخلايا على حرارة 300 × جم لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS المعقم.

أضف 5 ميكرولترات من صبغة 7-AAD إلى تعليق الخلية. امزج الخلايا برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 ملليلتر. احتضن لمدة 10 دقائق ، واتركه في الظلام قبل التحليل.

لإجراء مقايسة القدرة المحللة للخلايا ، امزج معلق الخلية وكرر التحضير لقياس التدفق الخلوي. انقر فوق عينة جديدة زر لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة. قم بتسمية الأنابيب كما هو موضح في بروتوكول النص.

لإنشاء نظام بوابات مبعثرة لمقايسة التحلل الخلوي ، أولا ، حدد الأنبوب 1 وانقر فوق الزر Dot Plot. لإنشاء مخطط FSC-A/SSC-A، ارسم بوابة مستطيلة على جميع الأحداث ذات عتبة FSC-A أكبر من 50,000 لاستبعاد حطام الخلية. حدد المعلمة SSC-A/CFSE للمخطط النقطي الجديد. بعد ذلك ، حدد المعلمة 7-AAD / CFSE للمخطط النقطي الجديد ، وارسم بوابة من أربعة أرباع لتحديد المجموعات الفرعية الأربعة.

انقر فوق تحميل العينة زر لتحليل نموذج التحكم الفارغ أولا. اضبط جهد SSC-A و FSC-A. حدد مجموعة الخلايا الميتة باستخدام معلمات قناة CFSE و 7-AAD. سجل البيانات من أكثر من 20,000 خلية إيجابية CFSE في كل عينة. افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية لكل عينة فردية لتحليل مجموعات الخلايا غير القابلة للحياة ، وتصدير البيانات إلى ملفات التحليل.