موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 3:40 دقيقة • July 8th, 2025
خذ خلايا سرطان الدم في وسط النمو دون تحفيز عوامل مثل السيتوكينات ، واحتضنها.
يسمح عدم وجود عوامل محفزة للبروتينات الفسفرة داخل الخلايا بالخضوع لإزالة الفسفرة والعودة إلى حالاتها الأصلية.
جهاز الطرد المركزي وإزالة الوسائط. أعد تعليق الخلايا في السدى الطافي الذي يحتوي على السيتوكين أو الليمفاوية اللحمية الصعترية أو TSLP.
يرتبط TSLP بمستقبله على خلية سرطان الدم ، مما يؤدي إلى إضعاف المستقبلات.
هذا يجعل الكينازات المرتبطة ب Janus ، أو JAKs ، أقرب ، مما يسهل نقل الفسفرة المتبادل.
تقومJAKs المنشطة بفسفرة ذيول السيتوبلازمية للمستقبل ، مما يخلق مواقع إرساء لمحول الإشارة ومنشط النسخ ، مونومرات STAT.
بمجرد أن تكون الفسفرة ، تتضاءل STATs وتنفصل عن المستقبل لتنظيم العمليات الخلوية في اتجاه مجرى النهر.
قم بإصلاح الخلايا للحفاظ على حالات الفسفرة للبروتينات داخل الخلايا.
عالج الخلايا بمحلول نفاذية لزيادة نفاذية غشاء الخلية.
أضف الأجسام المضادة المصنفة بالفلورسنت لتسمية البروتينات الفسفرية.
يرتبط قياس التدفق الخلوي لإشارة التألق بفسفرة STAT التي يسببها TSLP.
للتحقق من صحة المادة الطافية المنتجة من السدى المصمم هندسيا ، قم بإذابة عينات الطاف التي تم حصادها من التحكم في السدى الذي يعبر عن السيتوكينات ، ولوحة 3 آبار من خطوط خلايا سرطان الدم لكل حالة في وسط R20 عند 2 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز بئر في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 96 بئرا. احتضان الخلايا لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية للسماح بفقدان الفسفرة من ثقافتها السابقة.
ثم انقل الخلايا من كل بئر إلى أنابيب فردية سعة 4 ملليلتر ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الكريات في 600 ميكرولتر لكل حالة تجريبية ، وقم بطلاء 200 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر لكل حالة في ثلاث نسخ. احتضان الخلايا للفترة المناسبة وفقا لمقايسة الفوسفو التجارية المحددة.
في نهاية الحضانة ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وقم بتسمية الخلايا عن طريق تلطيخ قياس الخلايا بتدفق الفوسفو وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام بروتوكولات تحليل قياس التدفق الخلوي القياسية للتحقق من أن السيتوكين في السدى الطافي يفسفرة خلايا سرطان الدم.