تصور البكتيريا في أقسام خزعة المثانة عن طريق التهجين الموضعي الفلوري

ابدأ بشريحة زجاجية تحمل قسما من أنسجة خزعة المثانة البولية المصابة بإزالة البارافينات والمعاد ترطيبها تحتوي على بكتيريا مسببة للمسالك البولية.

أدخل مجسات عالمية ذات علامة فلورسنت - قليل النوكليوتيد تكميلي أحادي الشريطة خاص بالمنطقة المحفوظة من الحمض النووي الريبي الريبوزومي البكتيري 16s ، أو 16s-rRNA.

احتضن الشريحة في الظلام عند درجة حرارة مرتفعة للحصول على التهجين الأمثل.

أثناء الحضانة ، يتم تهجين المجسات حصريا إلى المنطقة المحفوظة على 16s-rRNA البكتيرية ، مما يضفي مضان أخضر على البكتيريا.

بعد التهجين ، اغسل بمخزن مؤقت مسخن مسبقا لإزالة المجسات غير المرتبطة.

بتلطيخ قسم الأنسجة بصبغة Hoechst وعلامات البروتين الخلوية المسماة بالفلوروفور.

ترتبط جزيئات Hoechst بالحمض النووي ، مما يؤدي إلى تلطيخ النوى باللون الأزرق ، بينما تتفاعل العلامات المسماة بالفلوروفور مع مكونات خلوية معينة مثل خيوط الميوسين والأكتين ، مما يضفي مضان أحمر في قسم الخزعة.

اغسل الشريحة وأضف وسائط التثبيت إلى قسم الأنسجة.

تحت المجهر متحد البؤر ، يؤكد التألق الأخضر داخل قسم خزعة المثانة الحامل للفلورة الحمراء البكتيريا المرتبطة بالأنسجة.

قم بإعداد غرفة ترطيب لكل مسبار عن طريق إضافة منديل مهمة مبلل ومتجعد ودقيق وماء معقم إلى خزان صندوق الأطراف P1000. ضع خرطوشة حامل الطرف في الأعلى ، حيث ستجلس الشرائح. عند اكتمال الغسيل النهائي ، قم بإزالة الشريحة من رف الشرائح ، وضعها على منشفة ورقية جديدة ، بحيث يكون جانب المناديل لأعلى. استخدم مناديل مهمة دقيقة لتجفيف الشريحة ، مع الحرص على التربيت برفق فقط بالقرب من قسم الخزعة ولكن ليس عليه لإزالة الماء. باستخدام قلم كاره للماء ، ارسم حدا حول قسم الخزعة ، وضع جانب الأنسجة المنزلقة لأعلى في غرفة الترطيب.

بعد ذلك ، ضع غرفة الترطيب في حاضنة مضبوطة على 50 درجة مئوية. ماصة بين 50 و 150 ميكرولتر من محلول التلوين مباشرة فوق الأنسجة بحيث يتم ملء المستطيل الذي يصنعه الحد الكارهة للماء حول الأنسجة ، وأغلق الصندوق برفق. احتضن طوال الليل عند 50 درجة مئوية في الظلام. إذا كانت الحاضنة تحتوي على نافذة ، فقم بتغطيتها بورق الألمنيوم لخلق بيئة مظلمة.

في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الشرائح من غرف الترطيب ، وتخلص بسرعة من أي محلول تهجين متبقي بمسح مهمة دقيق. ثم ضع الشرائح في رف تلطيخ عمودي. ضع رف التلوين في وعاء كوبلن ملفوف بورق الألمنيوم يحتوي على 100 مل من مخزن الغسيل الدافئ مسبقا لمدة 10 دقائق. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين أخريين باستخدام مخزن غسيل طازج في برطمانات كوبلين جديدة.

خلال خطوات الغسيل هذه ، قم بإعداد البقعة المضادة عن طريق تخفيف محلول مخزون Hoechst 33342 في مخزن الغسيل بنسبة 1 إلى 1,000. إلى نفس الأنبوب ، أضف Alexa-555 جرثومة القمح agglutinin إلى التركيز النهائي البالغ خمسة ميكروغرام لكل مليلتر و Alexa-555 phalloidin إلى التركيز النهائي البالغ 33 نانومولار. يحفظ في الظلام حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

عند اكتمال الغسيل النهائي ، قم بإزالة الشرائح من برطمان الكوبلين ، وتخلص برفق من أي مخزن غسيل زائد بمسح دقيق للمهام. ضع الشرائح بحيث يكون جانب المنديل لأعلى على منشفة ورقية ، وأضف ما بين 50 و 150 ميكرولترا من البقع المضادة مباشرة فوق الأنسجة بحيث تمتلئ الحدود الكارهة للماء ولكن لا تفيض. قم بتغطية ما يصل إلى أربع شرائح بسطح صندوق تبريد ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، ضع الشرائح مرة أخرى في رف التلوين ، واغسلها مرتين أخريين في برطمانات كوبلين تحتوي على محلول غسيل طازج ، مع كل غسلة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، جفف الشرائح جيدا ، وضعها على جانب المناديل لأعلى على منشفة ورقية أسفل سطح صندوق التبريد. اضغط على قطرة واحدة من وسائط التثبيت مباشرة فوق المنديل ، وضع برفق غطاء بحجم مناسب في الأعلى. اضغط برفق على أي فقاعات ، واترك الشرائح المنزلقة بالغطاء تلتئم طوال الليل في الظلام. في اليوم التالي ، أغلق حواف الأغطية على الشريحة بطبقة خفيفة من طلاء الأظافر الشفاف ، واتركها تجف في الظلام لمدة 10 دقائق ، قبل تخزينها في الظلام عند 4 درجات مئوية.

عندما تكون جاهزا لتصوير الخزعات الملطخة ، قم بتشغيل المجهر متحد البؤر والبرنامج المرتبط بالمجهر. ابدأ بشريحة إيجابية FISH وقم بالتبديل إلى وضع تصور الكمبيوتر. حدد القنوات 405 و488 و555. اضبط الثقب باستخدام أطول قناة ذات طول موجي ، والتي تكون في هذه الحالة 555. بعد ذلك ، أوجد المستوى البؤري الحالي لتصور البكتيريا المصنفة في القناة 488. بدون تغيير المستوى البؤري ، اضبط الكسب وطاقة الليزر والإزاحة لكل قناة ، بحيث لا تكون الإشارة مشبعة ، ولا يتم تصحيح الخلفية بشكل مفرط. احصل على الصورة في جميع القنوات الثلاث.