تقنية في المختبر لتوليد الخلايا التائية موت الخلايا المبرمج بوساطة الأشعة فوق البنفسجية

خذ معلقا لخلايا جوركات — خلايا ابيضاض الدم في الخلايا الليمفاوية التائية.

امزج كمية مع صبغة صلاحية الخلية وتأكد من عدد كاف من الخلايا الحية.

ضع الخلايا في طبق استزراع وقم بتطبيق الأشعة فوق البنفسجية C أو UVC ، والإشعاع للمدة المطلوبة.

يخترق الأشعة فوق البنفسجية الخلايا ويمتصه الحمض النووي ، مكونا منتجات ضوئية بيريميدين.

بعد التشعيع ، احتضان الخلايا. يؤدي تلف الحمض النووي الواسع النطاق بوساطة الأشعة فوق البنفسجية إلى بدء مسار موت الخلايا المبرمج الجوهري ، مما يؤدي إلى تنشيط البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج على غشاء الميتوكوندريا الخارجي.

تتحول البروتينات المنشطة إلى قلة القلة ، وتشكل مسام غشائية وتطلق السيتوكروم C من الفضاء بين الغشاء في السيتوبلازم.

مجمعات السيتوكروم C مع عامل تنشيط البروتياز موت الخلايا المبرمج -1 ، وتشكيل مركب المبرمج. ينشط الجوب المبرمج الكاسباسات ، مما يسبب موت الخلايا المبرمج.

أدخل الملحق V المسمى بالفلوروفور لتسمية الفوسفاتيديل سيرين على الغشاء ، وعلامة خلية موت الخلايا المبرمج ، وإضافة يوديد البروبيديوم الذي يدخل من خلال الغشاء التالف لتسمية الحمض النووي.

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، حدد الخلايا المبرمج المبكرة المسمى V والخلايا المبرمج المتأخرة ذات الصبغة المزدوجة.

ابدأ بزراعة الخلايا التائية جوركات في وسط زراعة الخلايا القاعدية ، المكملة وفقا لتوجيهات المخطوطة ، عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. الخلايا التائية Jurkat هي خط خلوي معلق يمكن الحفاظ عليه من خلال المرور إلى وسائط الاستزراع الدافئة مسبقا كل ثلاثة أيام.

قم بإعداد الخلايا المبرمج عن طريق زراعتها إلى 90٪ من التقاء ، والذي يستغرق من ثلاثة إلى أربعة أيام بعد المرور. قم بزراعة الخلايا في خمس قوارير T75 ، للحصول على عدد كاف من الخلايا لهذا البروتوكول. بمجرد أن تصبح الخلايا جاهزة ، قم بشفط محتويات القارورة حوالي 24 مليلتر ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. عد الخلايا باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق ومقياس كثافة الدم.

بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 271 مرة جم لمدة خمس دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في الوسائط للحصول على ثلاثة ملايين خلية لكل مليلتر. قم بتقسيم الخلايا إلى أطباق زراعة الأنسجة مقاس 100 × 20 ملم عن طريق نقل خمسة ملليلتر من الخلايا لكل طبق.

قم بإعداد ما يقرب من تسعة أطباق ثقافية. ضع طبقا واحدا جانبا كعنصر تحكم غير مكشوف ، وعرض الأطباق المتبقية للأشعة فوق البنفسجية. اضبط الرابط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية على مستوى الطاقة الصحيح بالضغط على زر الطاقة وإدخال "600" باستخدام لوحة الأرقام. قم بإشعاع جميع الأطباق بالخلايا باستثناء عنصر التحكم ، مع التأكد من إزالة الغطاء العلوي لطبق زراعة الأنسجة أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية.

بعد ذلك ، احتضن جميع الأطباق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات. بعد الحضانة ، اجمع جميع الخلايا المشعة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، وقم بتقطيعها عن طريق الطرد المركزي عند 271 مرة جم لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 24 مل من PBS المعقم. الطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى ، وإزالة المادة الطافية.