قياس إفراز الخلايا البدينة عن طريق إطلاق البروتين الفلوري الأحمر الأحادي الببتيد Y

خذ الخلايا البدينة المنقولة التي تعبر عن NPY-mRFP ، وهو بروتين اندماجي يحتوي على الببتيد العصبي Y وبروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي ، في حبيبات إفرازية السيتوبلازم.

قم بإزالة الوسائط. مخزن مؤقت يحتوي على الكالسيوم مع كاشف منشط ، ويونوفور الكالسيوم ، واحتضانة.

تحفز هذه الأيونوفورات تدفق الكالسيوم ، مما يزيد من تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ويحشد الحبيبات الإفرازية إلى غشاء البلازما.

يرتبط الكالسيوم بالبروتينات المرتبطة بالكالسيوم على الغشاء الحبيبي الإفرازي.

علاوة على ذلك ، تندمج الحبيبات الإفرازية مع غشاء البلازما بوساطة بروتينات مرتبطة بالغشاء ، مما يؤدي إلى إفراز الخلايا وإطلاق المحتويات ، بما في ذلك NPY-mRFP.

بعد الحضانة ، قم بجمع ونقل المادة الطافية التي تم إطلاقها المحتوية على NPY-mRFP إلى صفيحة سوداء متعددة الآبار.

أضف منظفا غير أيوني لتحلل الخلايا وتحرير NPY-mRFP المتبقي داخل الخلايا.

اجمع وانقل محللة الخلية إلى لوحة متعددة الآبار.

باستخدام قارئ لوحة مضان ، قم بقياس مضان المادة الطافية للخلية والتحلل لتحديد النسبة المئوية ل NPY-mRFP المنبعث وتحديد مدى إفراز الخلايا البدينة.

لقياس إفراز الخلايا NPY-mRFP ، قم بإزالة وسط الثقافة من اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واغسله ثلاث مرات باستخدام عازلة Tyrode. قم بإعداد الخلايا غير المحفزة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من عازلة Tyrode إلى آبار