تصوير فائق الدقة لتكوين المشبك المناعي للخلايا القاتلة الطبيعية على طبقة ثنائية دهنية مدعومة

قم بإعداد شريحة غرفة مع طبقة ثنائية دهنية مدعومة ، أو SLB ، تتكون من الدهون الفوسفورية والفوسفوليبيدات البيوتينية.

أضف البروتينات المانعة لمنع التفاعلات غير المحددة.

إدخال الستربتافيدين ، الذي يرتبط بالدهون الفوسفورية الحيوية.

أضف الأجسام المضادة المضادة ل CD16 ذات العلامات الفلورية الفلورية للبيوتينيل ، والتي ترتبط بالستربتافيدين الثابت

ماصة D-biotin لمنع الارتباط غير المحدد للستربتافيدين بالخلايا.

إدخال الخلايا القاتلة الطبيعية ، أو الخلايا الطبيعية ، ترتبط مستقبلات CD16 الموجودة على هذه الخلايا على وجه التحديد بالأجسام المضادة المضادة ل CD16 المرتبطة ب SLB ، وتشكل مشبك مناعي.

هذا الارتباط إلى إعادة ترتيب الأكتين واستقطاب الأنابيب الدقيقة ، مما يؤدي في النهاية إلى تشكيل مجموعات دقيقة في مركز المشبك الذي يحتوي على الأجسام المضادة المضادة ل CD16 المرتبطة ب SLB ومستقبلات CD16.

تستقطب الحبيبات اللايتية التي تحتوي على البيرفورين وتخترق من خلال خيوط الأكتين في المشبب.

إصلاح الخلايا. نفاذية الأغشية و SLB.

أضف الأجسام المضادة للفالودين والمضادة للبيرفورين المسمى بالفلورسنت ، والتي ترتبط بخيوط الأكتين والبيرفورين ، على التوالي.

باستخدام مجهر مضان فائق الدقة ، تصور توزيع خيوط الأكتين الفلورية والحبيبات موجبة البيرفورين في المشبك العصبي.

لتجميع طبقة الدهون المستوية المدعومة بالزجاج ، أولا ، قم بإعداد 100 مل من محلول سمكة الضاري المفترسة عن طريق خلط 30٪ بيروكسيد الهيدروجين مع حمض الكبريتيك بنسبة 1 إلى 3 في كوب. في هذا المحلول ، ضع غطاءين مستطيلين # 1.5 لمدة 20 إلى 30 دقيقة. أثناء تنظيف الأغطية ، استرجع أنبوبا واحدا من دهون DOPC المعدة مسبقا 400 ميكرومولار ، وأنبوب واحد من دهون البيوتين PE المعدة مسبقا 80 ميكرومولار. انقلهم على الجليد إلى خزان الأرجون.

بعد إزالة الأكسجين من أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد باستخدام الأرجون ، اجمع DOPC و Biotin-PE معا بنسبة 1 إلى 1. سيختلف الحجم المحدد بناء على الاحتياجات التجريبية ، ولكن يجب أن يكون ، على الأقل ، 2 ميكرولتر لكل منهما. قم بإزالة الأكسجين من أنبوب الخليط وأنابيب الكاشف الفردية قبل إعادة الأخير إلى الثلاجة.

بعد الانتهاء من التنظيف ، اشطف الأغطية جيدا بالماء المقطر. اضبط الغطاء ليجف في الهواء لبضع دقائق. بعد ذلك ، اسحب 1.5 ميكرولتر من خليط الجسيمات الشحمية ، وقم بتقطيعه في قطرة واحدة في إحدى غرف الممر في شريحة الغرفة. يعد استخدام قطرتين لكل حارة أمرا نموذجيا ولكنه ليس ضروريا.

الآن ، ضع الغطاء الجاف بسرعة وكفاءة فوق القطرات. تأكد من أن القطرات متباعدة بدرجة كافية بحيث لا تندمج بمجرد وضع الغطاء. علاوة على ذلك ، تأكد من أن القطرات تظل دائرية ومحددة جيدا ، دون لمس حواف جدران الغرفة. اضغط لأسفل بقوة ، بين كل حارة وحولها ، لضمان إحكام تسرب الماء بين الغطاء والانزلاق.

حدد مواضع القطرات باستخدام قلم تحديد. ثم مرر 100 ميكرولتر من الكازين المائي بنسبة 5٪ عبر الغرفة لمنع الطبقة الثنائية. حاول التأكد من عدم وجود فقاعات في غرفة التدفق. ثم قم بحقن 100 ميكرولتر من الستربتافيدين بتركيز 333 نانوغرام لكل مليلتر في كل حارة.

بعد الحضانة لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اغسلها بتشغيل 3 ملليلتر من محلول ملحي مخمول ب HEPES مع 1٪ ألبومين مصل بشري عبر كل حارة لإزالة الستربتافيدين الزائد. أضف 100 ميكرولتر من مضاد CD16 المضاد للبيوتينيل المسمى بالفلورسنت بتركيز البروتين المحدد مسبقا ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد الحضانة في الظلام لمدة 20 إلى 30 دقيقة ، اغسلها مرة أخرى عن طريق تشغيل 3 ملليلتر من محلول ملحي مخزن ب HEPES مع 1٪ من ألبومين المصل البشري في كل حارة. بعد ذلك ، قم بتدفق 100 ميكرولتر من D-biotin بتركيز 25 نانومولار عبر الغرفة من أجل ربط أي ستربتافيدين زائد ، وبالتالي القضاء على فرصة الارتباط غير المحدد للستربتافيدين بالخلايا.

بعد ذلك ، عد خلايا القاتل الطبيعي البشرية ، وأعد تعليقها بتركيز 500,000 لكل مليلتر في محلول ملحي مخزن ب HEPES مع 1٪ زلاليم مصل بشري. اغسل D-biotin خارج الغرفة ب 3 ملليلتر أخرى من محلول ملحي مخمول ب HEPES مع 1٪ ألبومين مصل بشري لكل حارة. بمجرد إعادة تعليق الخلايا بالتركيز المطلوب ، أضف 100 ميكرولتر إلى كل حارة. ضع الغرفة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

بعد فترة الحضانة هذه ، قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 20 دقيقة. اغسل عن طريق تشغيل 3 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات عبر كل حارة لإزالة بارافورمالدهايد. ثم أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب قبل الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ F-actin و perforin عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من الفالودين المخفف والملصق بالفلورسنت والأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للبيرفورين المسمى بالفلورسنت. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة قبل الغسيل عن طريق تشغيل 3 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات عبر الغرفة. الغرفة جاهزة للتصوير.

للبدء ، قم بتشغيل جميع وحدات الأجهزة الضرورية لمجهر STED. ابدأ تشغيل برنامج تحليل الصور ، وقم بتمكين كل من وحدات المسح بالرنين ووحدات STED. بعد إجراء هذه التحديدات ، انتظر حوالي ثلاث إلى خمس دقائق حتى يبدأ البرنامج.

انقر فوق علامة التبويب "التكوين" في الجزء العلوي من الشاشة. حدد تكوين الليزر. ثم قم بتشغيل الضوء الأبيض والليزر STED 592 نانومتر. اختر الهدف 100X ، وقم بمحاذاة شعاع ليزر الإثارة مع ليزر استنفاد 592 نانومتر. حدد وحدة تكوين الليزر. قم بإيقاف تشغيل ليزر النضوب 592 ، وقم بتشغيل ليزر النضوب 660 نانومتر.

ضع الشريحة على المسرح فوق العدسة. اجعل الخلايا المرتبطة بمنطقة الطبقة الثنائية المحددة في التركيز باستخدام مصباح الضوء الأبيض والعينات. بعد ذلك، ارجع إلى علامة التبويب اكتساب مباشرة على يسار علامة التبويب التكوين. انقر فوق علامة التبويب التبديل إلى الضوء الأبيض، ثم قم بتشغيل هذه الوحدة النمطية، واسحب خط ليزر الإثارة إلى الطول الموجي المناسب.

بعد تحديد الكاشف المطلوب وتعيين نطاق الكشف ، انقر فوق الزر المتسلسل في شريط الأدوات Acquire الأيسر لإظهار مربع حوار المسح المتسلسل في الجزء السفلي من شريط الأدوات الأيسر. يتيح ذلك للمستخدم إضافة تسلسلات متعددة ، لكل منها شعاع إثارة مختلف للون مختلف. انقر بين الإطارات، ثم قم بتعيين تردد الإثارة والكاشف ونطاق الكشف لكل لون إضافي. بمجرد تحسين جميع الإعدادات ، اضغط على ابدأ لبدء عملية الاستحواذ.