موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 2:40 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بحبيبات خلية تحتوي على خلايا قاتلة طبيعية أو الخلايا الطبيعية ، وخلايا مستهدفة ملطخة بالفلورسنت.
أعد تعليق الحبيبات في وسط مناسب واحتضنها.
تتفاعل الخلية القاتلة الطبيعية عبر بروتينات الالتصاق السطحية ، وتشكل مشبك مناعي مع الخلية المستهدفة.
يؤدي هذا إلى بدء إشارات الخلايا القاتلة الطبيعية ، وإطلاق حبيبات سامة للخلايا ، تحتوي على بيرفورين والجرانزيم في المشبب.
يخلق بيرفورين ، وهو بروتين مكون للمسام ، قنوات في غشاء الخلية المستهدفة ، مما يسمح للجرانزيم بدخول السيتوبلازم.
يتفاعل Granzyme ، وهو بروتياز سيرين ، مع البروتينات داخل الخلايا ، مما ينشط مسار موت الخلايا المبرمج في الخلية المستهدفة.
الآن ، أضف صبغة الفلورسنت بروبيديوم يوديد.
تدخل الصبغة الخلايا الميتة من خلال أغشيتها التالفة وترتبط بالحمض النووي عن طريق الإقحام بين أزواج قواعدها.
وبالتالي ، تعبر الخلايا الميتة عن فلوروكروم مزدوج بينما تعبر الخلايا الحية عن فلوروكروم واحد.
العينة جاهزة لقياس التدفق الخلوي لتقييم السمية الخلوية التي تسببها الخلايا القاتلة الطبيعية عن طريق تحديد أعداد الخلايا المستهدفة الميتة والحية.
لتحضير عينة فحص السمية الخلوية ، قم أولا بتسمية أنابيب سعة 1.5 ملليلتر لكل عينة و / أو مشارك حسب الاقتضاء ، وقم بوضع الماصة النسبة المطلوبة من الخلايا القاتلة الطبيعية ، وخلايا K562 المسمى DiO في كل أنبوب.
اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية. بعد ذلك ، أعد تعليق خليط الخلية في 500 ميكرولتر من وسط الخلية القاتلة الطبيعية غير المكتمل ، وقم بتسمية الخلايا الموجودة في كل أنبوب ب 5 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم.
اجمع الخلايا عن طريق طرد مركزي آخر ، واحتضان المزرعة الباردة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا في نفس ظروف الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 25 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا القاتلة الطبيعية الطازجة والكاملة.