تحضير شرائح الرئة البشرية المقطوعة بدقة على الاغاروز

ابدأ برئة بشرية مقطوعة.

أدخل أنبوب سيليكون في الشعب الهوائية الرئيسية للرئة. قم بتأمين الأنبوب ، مما يوفر مسارا لإدخال الاغاروز في الأنسجة في الخطوات اللاحقة.

قم بتثبيت القصبات الهوائية والأوعية الأخرى لمنع تسرب الاغاروز أثناء التعبئة.

أدخل الاغاروز منخفض التبلور الممزوج بالوسائط الممزوجة بالوسائط في الرئة حتى يتم نفخها بالكامل.

ضع الرئة على الجليد لبلمرة الاغاروز ، وتشكيل مصفوفة هلامية صلبة توفر الاستقرار للأنسجة وتحافظ على بنية الرئة أثناء إجراءات التقسيم.

بعد البلمرة ، قم بتقطيع أنسجة الرئة إلى ألواح موحدة. استخراج نوى الأنسجة الأسطوانية من ألواح الأنسجة.

باستخدام قطاعة الأنسجة المملوءة بمحلول مبرد ، قم بتقطيع قلب الأنسجة للحصول على شرائح رئة مقطوعة بدقة.

انقل الشرائح إلى طبق ثقافة يحتوي على وسائط مبردة. احتضان لتثبيت الأنسجة.

أخيرا ، انقل الشرائح إلى طبق متعدد الآبار يحتوي على وسائط. شرائح الرئة المعدة بدقة جاهزة الآن للتجارب.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتقطيع القصبة الهوائية عن طريق إدخال أنبوب السيليكون ، وتثبيته بمشبك مواز للأنبوب بحيث يضغط المشبك على الأنسجة معا بجانب أنبوب السيليكون دون الضغط عليه. أغلق جميع الشعب الهوائية والأوعية الدموية والإصابات الأخرى بمشابك حتى لا يتسرب أي أغاروز أثناء إجراء الحشو.

هناك حاجة إلى مهارات تشريحية جيدة لاستخلاص الشعب الهوائية الرئيسية. لا ينبغي توسيع الرئتين كثيرا وإلا فإن الأنسجة ستشتت انتباهها ، وإذا لم تمتلئ الأنسجة بدرجة كافية ، فسيكون من المستحيل عمل أي PCLS لأن الأنسجة ناعمة جدا.

بعد ذلك ، امزج حجما مكافئا بنسبة 3٪ من agarose منخفض التبلور مع وسط الثقافة في دورق ، وغرس الخليط في الرئة باستخدام حقنة سعة 50 ملليلترا. قبل إعادة تعبئة المحقنة بوسط ، أغلق القسطرة بالأصابع أو المشبك لتجنب فقاعات الهواء والتدفق الخالي من الاغاروز. قطع أنسجة الرئة إلى ألواح من 3 إلى 5 سم.

املأ قطاعة الأنسجة ب 400 مل من EBSS المثلج. على الفور ، قم بقطع نوى الأنسجة الأسطوانية من ألواح الرئة باستخدام مفك براغي شبه آلي مزود بأداة حفر. بعد ذلك ، انقل نوى الأنسجة إلى حامل الأنسجة في قطاعة الأنسجة. ضع الوزن أعلى قلب الأنسجة وابدأ في تقطيع قلب الأنسجة إلى PCLS. يجب تصريف الوسط من قطاعة الأنسجة إلى دورق عن طريق فتح مشبك الأسطوانة الزجاجية.

بعد ذلك ، انقل الشرائح من دورق إلى طبق بتري مع وسط الاستزراع. بعد ذلك ، ضع طبق بتري في حاضنة واترك الوسط يسخن قبل خطوات الغسيل. بعد ذلك ، انقل شرائح الرئة بعناية إلى صفيحة استزراع 24 بئرا بحد أدنى 500 ميكرولتر من وسط الزراعة لشريحتين لكل بئر.