اختبار لقياس السمية الخلوية المستحثة كيميائيا في شرائح الرئة البشرية المقطوعة بدقة

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على شرائح رئة بشرية مقطوعة بدقة ، والتي تحافظ على الهندسة المعمارية الدقيقة للرئة الأصلية.

إزالة الوسائط. أضف تركيزات عامل اختبار متزايدة إلى الآبار واحتضنها.

اعتمادا على إمكاناته السامة للخلايا ، يعطل عامل الاختبار أغشية الخلايا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا وتقليل الخلايا القابلة للحياة داخل الشرائح.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسائط. اغمر الشرائح في وسائط تحتوي على ملح التيترازوليوم القابل للذوبان في الماء ، أو WST-1 ، وكاشف اقتران الإلكترون.

حضن. في الخلايا النشطة الأيضية ، ينقل نظام نقل الإلكترون في غشاء البلازما الإلكترونات من NADH داخل الخلايا إلى كاشف اقتران الإلكترون خارج الخلية ، مما يقلل من الصبغة غير المنفذة للخلية WST-1 إلى فورميزان مستقر ، أصفر داكن ، قابل للذوبان في الماء.

بعد الحضانة ، رج الطبق لتوزيع الفورمازان بالتساوي ونقله إلى طبق متعدد الآبار.

باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس امتصاص الفورميزان ، مما يدل على صلاحية الأنسجة.

يشير

انخفاض امتصاص الفورمازان ، اعتمادا على تركيز عامل الاختبار ، إلى انخفاض قابلية صلاحية شريحة الرئة ، مما يؤكد السمية الخلوية لعامل الاختبار.

لتحضير مزيج رئيسي من محلول العمل ، قم بتخفيف 25 ميكرولترا من كاشف WST-1 و 225 ميكرولتر من الوسط لكل بئر. بعد ذلك ، قم بتعبئة 250 ميكرولتر من محلول عمل الخلط الرئيسي ل WST-1 لكل بئر ، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تأكد من تغطية PCLS بالكامل بواسطة كاشف WST-1 أثناء الحضانة.

بعد ذلك ، ضع اللوحة على شاكر مداري عند 200 دورة في الدقيقة ، ورج بعناية لمدة 30 ثانية لضمان الخلط الشامل لكاشف WST-1. بعد ذلك ، قم بإخراج 100 ميكرولتر من المادة الطافية من كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا إلى صفيحة جديدة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا في نسخ مكررة. قم بقياس امتصاص كل بئر عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة، واطرح الامتصاص عند مرجع 630 نانومتر من الامتصاص عند 450 نانومتر.