تقنية في المختبر لتصور إفراز الخلايا الإفرازية في الخلايا البدينة

خذ غطاء زجاجيا يحتوي على خلايا بدينة - خلايا مناعية ذات حبيبات إفرازية ، أو SGs ، تحتوي على وسطاء التهابيين.

أضف الأجسام المضادة IgE جنبا إلى جنب مع محضر الفلورسنت الحساس للأس الهيدروجيني ، واحتضن.

ترتبط الأجسام المضادة بمستقبلات Fc على الخلايا البدينة. يتم استيعاب المراسلين عن طريق كثرة الخلايا ، وتندمج الجسيمات الداخلية الناتجة مع SGs.

قم بإزالة الوسائط. أضف مستضد يحتوي على العديد من حواتم ربط IgE. ضع الشريحة تحت المجهر الفلوري ، وقم بتطبيق الطول الموجي المطلوب للإثارة

يعمل الرقم الهيدروجيني الحمضي ل SGs على إخماد مضان المراسل.

يرتبط المستضد بمجمعات مستقبلات IgE على سطح الخلية ، ويربط بينها.

يؤدي

تجميع المستقبلات بوساطة المستضد إلى هجرة SGs نحو غشاء البلازما.

تتوسط بروتينات SNARE على البلازما وغشاء SG اندماج الغشاء وتصريف شحنات SG ، والتي تسمى إفراز الخلايا.

يتسبب ارتفاع درجة الحموضة في الوسط في قلوية SG ، مما يحفز المراسلين على استعادة التألق.

تندمج SGs الواردة مع تلك المنصهرة بالغشاء. تتوسط قلوية SG الثانية في استعادة التألق ، مما يؤكد إفراز الخلايا المركب.

أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى غطاء زجاجي مع وسائط استزراع جديدة مكملة ب FITC-dextaren ، وقم بتنمية خلايا RBL بين عشية وضحاها. أولا ، قم بإعداد حل المخزن المؤقت النهائي ل Tyrode وفقا لبروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بإعداد كاشف إفرازات 20x في المخزن المؤقت الطازج.

قم بإذابة مسحوق كلوريد الأمونيوم في عازلة Tyrode لإنشاء محلول كلوريد الأمونيوم 400 ملليمول. بعد ذلك ، قم بشفط الوسائط من الغطاء الزجاجي المحاط ، واستبدله ب 300 ميكرولتر من عازلة Tyrode الدافئة مسبقا. بعد تكرار عملية الغسيل مرتين ، قم بتجديد الغرفة ب 300 ميكرولتر من عازلة Tyrode.

بعد ذلك ، ضع الغطاء الزجاجي في غرفة الحاضنة في المجهر ، وتأكد من استقرار الغرفة. قم بتشغيل مصدر ضوء الفلورسنت وحدد مرشح التألق المناسب. بمجرد أن تصبح منطقة الاهتمام في منتصف مجال الرؤية ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء.

بعد ذلك ، قم بتشغيل الليزر 488 نانومتر مع الانبعاثات المجمعة حوالي 500 إلى 550 نانومتر. بعد ذلك ، قم بمعايرة الفاصل الزمني بين عمليات الحصول على الصور. اضبط اتجاه المسح الضوئي على "ثنائي الاتجاه". لا تسمح بحساب المتوسط. افتح الثقب ، واضبط الدقة على 512 × 512.

بعد ذلك ، قم بتصوير الخلايا للمدة المناسبة لنوع الخلية أو الإفراز المحدد. ثم أضف 16 ميكرولترا من محلول الإفراز إلى الغرفة واستمر في التصوير. أخيرا ، لتأكيد وجود وتوطين FITC-dextern في الحبيبات الإفرازية ، أضف برفق 16 ميكرولترا من محلول كلوريد الأمونيوم إلى الغرفة.