اختبار Opsono-Paledence لتقييم Opsonization للبكتيريا المغلفة بواسطة الأجسام المضادة للكبسولة

خذ معلقا من Bacillus anthracis المقتول كيميائيا والمصنف بالفلورسنت.

الكبسولة البكتيرية ، المكونة بشكل أساسي من حمض بولي جاما الجلوتاميك ، الحماية ضد البلعمة.

خذ مصل الرئيسيات غير البشري ، معطل بالحرارة لتدمير البروتينات التكميلية. تحتوي هذه الأمصال ، المعزولة من المحصنة بلقاح قائم على الكبسولة البكتيرية ، على أجسام مضادة للكبسولات.

أضف المعلق البكتيري المقتول كيميائيا إلى المصل. ترتبط الأجسام المضادة على وجه التحديد بالكبسولات البكتيرية ، مما يسهل التظليم البكتيري وتمييزها للتخلص منها بواسطة الخلايا البلعمة. أضف البروتينات التكميلية القياسية لتعزيز التظليل.

نقل البكتيريا الضامة إلى الضامة الملتصقة — الخلايا البلعمة. احتضن لفترة وجيزة.

ترتبط الأجسام المضادة والبروتينات التكميلية على البكتيريا بمستقبلات Fc الضامة والمستقبلات التكميلية ، على التوالي ، مما يعزز الالتصاق البكتيري.

إزالة الوسائط. يغسل بمحلول عازل لإزالة البكتيريا غير الملتصقة.

إصلاح الخلايا للحفاظ على سلامة الخلوية.

استخدم بقعة فلورية لتسمية البلاعم.

باستخدام المجهر الفلوري ، لاحظ البكتيريا الفلورية الملتصقة بالضامة الفلورية المختلفة ، مما يؤكد التظليل البكتيري الفعال بواسطة الأجسام المضادة للكبسولة.

اغسل المخزون البكتيري المعطل ثلاث مرات في PBS لإزالة المثبت. أضف محلول FITC بتركيز نهائي قدره 75 ميكروغرام لكل ملليلتر. حرك الخليط ببطء لمدة 18 إلى 24 ساعة عند أربع درجات مئوية. اغسل البكتيريا كما كان من قبل لإزالة FITC الزائد.

بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق العصيات في PBS بنفس حجم البدء. Aliquot وتخزين العصيات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تعطيل الحرارة كمية صغيرة من مصل الاختبار من الرئيسيات غير البشرية عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، في كتلة حرارية أو جهاز PCR. قم بإذابة وغسل البكتيريا المسماة ب FITC باستخدام PBS مرتين عن طريق التكوير عند 15,000 مرة جم لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. قم بالتعليق في PBS في نفس وحدة تخزين البدء.

في صفيحة مستديرة القاع سعة 96 بئرا ، قم بتخفيف مصل الاختبار بشكل متسلسل في وسط الخلية. في طبق آخر ذو 96 بئرا مستديرة القاع ، أضف 10 ميكرولترات من مصل الاختبار المخفف في كل بئر. ثم أضف 10 ميكرولتر من مكمل الأرانب الصغيرة المعاد تكوينه حديثا.

إلى اللوحة رقم ثلاثة ، أضف الحجم المناسب من العصيات المسماة ب FITC لتعدد العدوى 20 ، على سبيل المثال ، بحجم يحتوي على 50,000 في 20 عصيات ل 50,000 خلية. قم بتعبئة كل بئر في اللوحة رقم ثلاثة بالحجم المناسب لوسط الخلية حتى إجمالي 105 ميكرولتر. احتضان اللوحة رقم ثلاثة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 مع الرطوبة لمعالجة العصيات.

ضع اللوحة رقم واحد التي تحتوي على خلايا ملتصقة على كتلة حرارية 37 درجة مئوية. استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة الوسط المستهلك من الآبار واستبدلها بسرعة ب 100 ميكرولتر من البكتيريا المزيلة من اللوحة رقم ثلاثة لضمان عدم إنشاء فقاعات في الآبار أثناء سحب العينات. حتى لا تزعج الخلية أحادية الطبقة ، أضف حجما إلى جوانب الآبار.

احتضان اللوحة رقم واحد عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة لمدة 30 دقيقة للالتصاق. اغسل كل بئر خمس مرات باستخدام 150 ميكرولتر من PBS فوق كتلة حرارية 37 درجة مئوية لإزالة العصيات غير المرفقة. الماصة على جانب الآبار لضمان عدم تشتت الخلايا عن طريق الخطأ أثناء الغسيل. أضف 150 ميكرولترا من 4٪ بارافورمالدهايد إلى كل بئر ، وقم بإصلاح الخلايا لمدة ساعة واحدة.

بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، امزج ميكرولترين من صبغة الخلايا البرتقالية عالية المحتوى في 10 ملليلتر من PBS. ثم أضف 150 ميكرولترا من محلول التلوين هذا إلى الخلايا الثابتة ، واحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة. ضع اللوحة رقم واحد على المسرح وركز على الخلايا باستخدام تباين المجال الساطع أو الطور.

في علامة التبويب اكتساب، حدد تنسيق 96-Well كإعداد اللوحة ثم حدد إعدادات القناة. بعد ذلك، حدد الإعداد إلى وضع التجانب. حدد عدد الصور التي سيتم الحصول عليها. قم بتغيير وضع الاكتساب إلى أبيض وأسود أو أحادي اللون، واضبط التجميع على 2 × 2 على الأقل. قم بتشغيل التركيز البؤري التلقائي أو وحدة التركيز البؤري. حدد عدد المرات التي سيتم فيها تنفيذ وظيفة التركيز البؤري التلقائي.

بعد ذلك ، قم بتشغيل وظيفة z-stack إذا كانت متوفرة ، وتشير إلى عدد z-stacks التي ستلتقط سمك الخلية أحادية الطبقة والعصيات الملتصقة. قم بتعيين مجلد ملف لحفظ الصور فيه. الآن ، قم بتشغيل برنامج التصوير الآلي. قم بجمع البيانات وتحليلها، كما هو موضح في بروتوكول النص.