تقييم تنشيط الخلايا التائية الخاضعة للرقابة باستخدام معقد التوافق النسيجي الكبير الببتيد القابل للتنشيط الضوئي

ابدأ بطلاء غطاء زجاجي ببولي إل ليسين البيوتينيل لإنشاء سطح غني بالبيوتين.

بعد ذلك ، أدخل الستربتافيدين - وهو بروتين يرتبط بالبيوتين ، ويشكل جسرا جزيئيا للتفاعلات اللاحقة.

بعد ذلك ، أضف الببتيدات المقفصة باللون البيوتينيل المرتبطة بمجمعات التوافق النسيجي الرئيسية - pMHCs جنبا إلى جنب مع جزيئات الالتصاق.

تتفاعل روابط pMHC الحيوية وجزيئات الالتصاق مع مناطق معينة على الستربتافيدين ، مما يتيح تجميدها.

بعد ذلك ، اغسل الغطاء بمحلول ملحي مخزن بشكل متكرر وأدخل الخلايا التائية.

إن وجود قفص ضوئي ، وهو مجموعة كيميائية حساسة للضوء مرتبطة ببقايا معينة على الببتيد ، يعيق الارتباط التلقائي لمستقبل الخلية التائية بالببتيد.

لتنشيط الخلايا التائية الخاضعة للرقابة ، قم بتعريض الببتيدات المقفصة للأشعة فوق البنفسجية.

يكسر ضوء الأشعة فوق البنفسجية الرابطة الكيميائية بين مركب الببتيد الضوئي ، مما يكشف الشكل الأصلي للببتيد.

تحدد مستقبلات الخلايا التائية الببتيدات المكشوفة وترتبط بها ، بينما ترتبط الإنتجرينات بجزيئات الالتصاق ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا التائية.

ابدأ بإضافة بولي إل ليسين البيوتينيل أو bio-PLL المخفف من 1 إلى 500 في الماء المقطر منزوع الأيونات إلى 8 زجاج غطاء بغرف 8 آبار. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، يغسل بالماء المقطر منزوع الأيونات ، ثم يجفف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

سد الأسطح المطلية ب PLL الحيوي مع عازل مانع يتكون من محلول ملحي مخزن HEPES مع 2٪ BSA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت المانع من الأسطح المطلية ب PLL الحيوي دون السماح للآبار بالجفاف. ثم أضيفي الستربتافيدين واحتضنها عند 4 درجات مئوية.

بعد ساعة ، اغسل الأسطح المطلية في HBS. املأ واقلب آبار منزلق الغرفة من 4 إلى 5 مرات ، وقم بإزالة HBS من الآبار. لا تدع الآبار تجف.

أضف الببتيد القابل للتنشيط الضوئي الحيوي ، والروابط المعقدة ذات التوافق النسيجي الرئيسي وجزيئات الالتصاق إما للخلايا التائية الإيجابية CD4 أو الخلايا الإيجابية CD8 إلى الأسطح المطلية ب PLL الحيوي. حماية من الضوء, واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسليها كما كان من قبل واتركيها في HBS حتى تصبح جاهزة للبذور. أخيرا ، أضف 200,000 خلية تائية موجبة CD4 أو CD8 موجبة ، معبرة عن TCR المناسب في الآبار الصحيحة ، واسمح للخلايا بالالتصاق عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بمجرد أن تلتصق الخلايا بالسطح وتنتشر عليه ، فإنها تكون جاهزة للتنشيط الضوئي والتصوير. استخدم مجهر مضان انعكاس داخلي مقلوب مزودا بعدسة موضوعية 150x متوافقة مع الأشعة فوق البنفسجية للحصول على الصور. راقب المجسات في كل من القناتين الخضراء والحمراء باستخدام ليزر الإثارة 488 نانومتر و 561 نانومتر على التوالي.

بعد تركيب شريحة الغرفة التي تحتوي على الخلايا التائية ، اضبط إعدادات المجهر للحصول على إضاءة TIRF أو التألق حسب الضرورة. في الوضع المباشر ، حدد مجالا من الخلايا التي تعبر عن مجسات الفلورسنت ذات الأهمية. إنشاء مناطق على نطاق ميكرون للتنشيط الضوئي أسفل الخلايا الفردية باستخدام التحكم في البرنامج. ثم ابدأ عملية الاستحواذ.

عادة ، يتم الحصول على 80 نقطة زمنية بفاصل زمني قدره 5 ثوان بين كل منها. هذا يترك وقتا للتعريض المتسلسل 488 نانومتر و 563 نانومتر في حالة التجارب ثنائية اللون. بعد ذلك ، بعد الحصول على 10 نقاط زمنية ، قم بتنشيط المناطق المحددة عن طريق فتح غالق الحجاب الحاجز الرقمي لمدة 1 إلى 1.5 ثانية. بعد اكتمال اللقطات المتتابعة، حدد حقلا جديدا من الخلايا، وكرر العملية.