طريقة توطين التألق المناعي في الجسم الحي لدراسة التوزيع الحيوي للأجسام المضادة

خذ نموذجا للفئران لسرطان الثدي. تتكون أورام الغدد الثديية من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والخلايا الشحمية والخلايا المناعية والأوعية الدموية الورمية.

حقن الأجسام المضادة الخاصة بالورم المترافق بالفلوروفور عن طريق الوريد.

عند الوصول إلى الأوعية الدموية للورم ، ترتبط الأجسام المضادة ببروتينات الغشاء الخاصة بالورم على بطانة الأوعية الدموية والخلايا السرطانية القريبة.

عزل الغدة الثديية جراحيا وغمرها في وسط تجميد.

احصل على أقسام التبريد على شريحة واشطفها بمخزن مؤقت لإزالة وسط التجميد.

إصلاح الأقسام للحفاظ على بنية الأنسجة. ضع منظفا لتعزيز التلوين المناعي ومحلول مانع لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

إدخال جسم مضاد أولي خاص بجزيئات الالتصاق على بطانة الأوعية الدموية ، وجسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروفور يرتبط بالجسم المضاد الأساسي ، مع تسمية الأوعية الدموية.

أضف وسيط تثبيت على الشريحة ، وضع غطاء غطاء.

تحت المجهر متحد البؤر ، قم بتقييم التوزيع الحيوي للأجسام المضادة الخاصة بالورم داخل وحول الأوعية الدموية للورم المسمى بالفلورسنت.

بعد التخدير كما هو موضح في بروتوكول النص ، استعد لتلقيح محاليل الأجسام المضادة في الوريد الذيل. تطهير ذيل عن طريق المسح ثلاث مرات بمنديل كحولي. قم بتوسيع عروق الذيل عن طريق التسخين باستخدام وسادة حرارية لمدة 30 ثانية تقريبا ؛ تجنب تسخين بأكمله. باستخدام قسطرة ريشة ذيل قياس 27 ، أدخل إبرة الفراشة في أحد وريد الذيل الجانبية.

تخيل تدفق الدم العكسي إلى القسطرة للتأكد من وضع الإبرة بشكل صحيح بحيث تدخل المحاليل بالكامل إلى مقابل التقاطها في الذيل.

استخدم قطعة من الشريط الجراحي لتثبيت الذيل بعناية باستخدام الإبرة التي تم إدخالها على المسرح. اغسل القسطرة ب 25 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات. بعد ذلك ، قم بحقن محلول الأجسام المضادة في القسطرة باستخدام محاقن الأنسولين. اغسل القسطرة مرة أخرى ب 25 ميكرولتر من PBS المعقم. قم بإزالة الإبرة من الذيل ، واضغط لوقف أي نزيف.

قم بإجراء القتل الرحيم الإنساني للماوس ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، ووضع الماوس في وضع ضعيف. استخدم المقص الجراحي والملقط لاستئصال أنسجة الورم. استخدم الملقط لاستيعاب الطبقة الخارجية فقط من الجلد بين مجموعة الغدد الثديية الأقرب إلى الذيل ، ولعمل شق صغير باستخدام مقص جراحي. أدخل المقص المغلق في الجرح ، وافتح الطرف ببطء لفصل الجلد بعناية عن غشاء جدار البطن الأساسي ، مع إبقائه سليما.

قم بعمل شق عمودي في البطن ، مع الاستمرار في فصل الجلد عن الغشاء الداخلي. بين الغدد الثديية الثالثة والرابعة ، قم بعمل قطع أفقي عبر البطن ، للسماح بتراجع الجلد وتصور الغدد الثديية. يمسك كل ورم أو غدة طبيعية بالملقط ، وقم بقص الجلد المرفق بعناية باستخدام مقص جراحي.

ضع المناديل المقطوعة في قوالب قاعدة يمكن التخلص منها من الأنسجة والتي تم تصنيفها مسبقا وتعبئتها بوسط تضمين درجة حرارة القطع الأمثل. قم بتجميد القوالب بسرعة عن طريق وضعها على الثلج الجاف. من أجل دراسة الولادة خارج الهدف ، استئصال الأنسجة أو الأعضاء الأخرى ذات الأهمية. باستخدام ناد التبريد ، قم بتقسيم كتل الأنسجة المجمدة بسمك 10 ميكرون ، ووضع الأقسام المجاورة على شرائح زجاجية لاصقة مسبقة الوصف.

اشطف شرائح المناديل المجمدة باستخدام PBS بدرجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لإزالة وسط التضمين. حدد أقسام الأنسجة بقلم حاجز كاره للماء لتقليل حجم المحاليل اللازمة أثناء التلوين. ثبت أقسام الأنسجة بمحلول بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 5 دقائق. بعد شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ، قم باختراق أقسام الأنسجة باستخدام 0.5٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة. اشطف الشرائح مرة أخرى في PBS لمدة 5 دقائق.

قم بمنع الأنسجة باستخدام PBS الذي يحتوي على 3٪ وزن لكل حجم من مصل الأبقار وحجم 5٪ لكل حجم مصل الماعز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ، احتضان الأقسام بأجسام مضادة أولية لحفظ السجلات ، مثل علامة نووية أو وعائية أو سيتوبلازمية شائعة. هنا ، يتم استخدام CD31 المضاد للفأر بتخفيف من 1 إلى 100 في محلول الحظر. تترك الشرائح التي تحتوي على أجسام مضادة أولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، محمية من الجفاف على صينية منزلقة.

بعد الحضانة ، اشطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات. قم بتغيير PBS في كل مرة. احتضان الشرائح بالأجسام المضادة الثانوية لتسمية الأجسام المضادة الأولية. بالنسبة لهذا التطبيق ، تصور الجسم المضاد المضاد ل B7-H3 باستخدام الجسم المضاد للماعز المترافق AlexaFluor-546 ، وتصور CD31 مع الجسم المضاد الثانوي للماعز AlexaFluor-488 المضاد للفئران في محلول الحظر. حماية الشرائح من الضوء والجفاف على صينية منزلقة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد شطف الشرائح في PBS ، كما كان من قبل ، ضع قطرة واحدة من وسط التثبيت في وسط شريحة الأنسجة. ضع غطاء بعناية لتجنب انحباس فقاعات الهواء. أغلق حواف الغطاء بطلاء أظافر شفاف واتركه حتى يجف. تابع التصوير المجهري متحد البؤر والتحليل الكمي للصور ، كما هو موضح في بروتوكول النص.