مقايسة التألق المناعي لتوصيف وقياس حبيبات الإجهاد في الثدييات

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على خلايا الساركوما العظمية الملتصقة على الغطاء.

تتم معالجة خلايا سرطان العظام هذه مسبقا بمادة كيميائية مسببة للإجهاد ، مما يؤدي إلى تكوين حبيبات الإجهاد.

حبيبات الإجهاد عبارة عن عضيات خالية من الغشاء السيتوبلازمي تتكون من mRNAs غير مترجمة ، ووحدات فرعية ريبوسومية صغيرة ، وبروتينات مرتبطة بالحمض النووي الريبي ، أو RBPs ، وعوامل متعلقة بالترجمة ، وبروتينات الإشارات.

تخلص من الوسائط واغسل الخلايا بمخزن مؤقت. إصلاح الخلايا للحفاظ على التشكل الخلوي.

تخلل الخلايا للوصول إلى الأهداف داخل الخلايا. أضف البروتينات المانعة لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

إدخال الأجسام المضادة الأولية التي ترتبط ب RBPs محددة وعوامل متعلقة بالترجمة داخل حبيبات الإجهاد.

احتضان الأجسام المضادة الثانوية المختلفة المسماة بالفلوروفور وصبغة Hoechst.

ترتبط الأجسام المضادة الثانوية بالأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالبروتينات المرتبطة بحبيبات الإجهاد ، بينما تلطخ جزيئات Hoechst الحمض النووي.

قم بتركيب أغطية تحتوي على خلية باستخدام وسائط التثبيت.

باستخدام المجهر الفلوري ، راقب الخلايا لتصور وقياس حبيبات الإجهاد ، والتي تظهر على شكل بؤر فلورية تتميز بالتوطين المشترك للبروتينات المرتبطة بها.

لإصلاح الخلايا ، قم بإزالة الوسائط من الآبار ، واغسل الخلايا بحوالي 250 ميكرولتر من PBS. أضف ما يقرب من 250 ميكرولترا من محلول بارافورمالدهيد مخزن 4٪ لإصلاح الخلايا ، مع التأكد من تغطية الجزء العلوي من الغطاء بالكامل. ثم اترك الطبق على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة والتخلص من بارافورمالدهيد بشكل صحيح.

أضف ما يقرب من 250 ميكرولتر من الميثانول المثلج لاختراق الخلايا وتسطيحها. احتضان اللوحة لمدة 5 دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة على هزاز. بمجرد اكتمال النفاذية ، تخلص من الميثانول وسد الخلايا عن طريق تطبيق ما يقرب من 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الجسم المضاد الأساسي عن طريق إضافة 12 ميكرولترا من الأجسام المضادة ضد G3BP1 و eIF4G و eIF3b إلى 3 ملليلتر من المخزن المؤقت المانع.

أضف 250 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا. احتضان اللوحة على الروك لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد وغسل الخلايا بحوالي 250 ميكرولتر من PBS لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، أضف 12 ميكرولترا من الأجسام المضادة Cy2 المضادة للفأر ، ومضادة للأرانب Cy3 ، ومضادة للماعز Cy5 مع 3 ميكرولترات من صبغة Hoechst إلى 3 ملليلتر من المخزن المؤقت المانع لتحضير محلول الجسم المضاد الثانوي.

أضف 250 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد الثانوي لكل بئر ، وقم بتغطية اللوحة لحماية العينات من الضوء. احتضان اللوحة على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. عند اكتمال الحضانة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد ، واغسل الخلايا باستخدام PBS لمدة 5 دقائق. وسط تركيب الحرارة في كتلة الحرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتقليل اللزوجة. بعد ذلك، باستخدام طرف ماصة مقطوعة مسبقا سعة 200 ميكرولتر، ضع 25 ميكرولترا من وسط التركيب على شريحة زجاجية تحمل علامة مميزة.

باستخدام ملقط دقيق ، انقل الغطاء من البئر إلى الشريحة ، مع عكس الجزء العلوي بحيث تواجه الخلايا وسط التثبيت. استخدم طرف P200 نظيفا للضغط على الغطاء لأسفل. بمجرد تركيب جميع أغطية الغطاء ، قم بإزالة وسط التثبيت الزائد عن طريق الضغط على منديل المختبر بقوة على الشريحة. بعد ذلك ، اغسل الشريحة بالماء ، وامسحها على الفور بأنسجة المختبر مرة أخرى.