مراقبة وصول البروتينات السطحية الموسومة ب GFP إلى شبكة عبر جولجي باستخدام الأجسام النانوية الوظيفية

ابدأ بالخلايا السرطانية المحرومة من الكبريتات التي تعبر عن بروتين سطحي يحمل علامة GFP.

أضف الكبريتات ذات العلامات الإشعاعية والأجسام النانوية المعدلة المضادة ل GFP - جسم مضاد أحادي السلسلة يحمل شكل كبريتات التيروزين ، واحتضنها.

تستوعب الخلايا المحرومة من الكبريتات الكبريتات ذات العلامات الإشعاعية ، ودمجها في المكونات الخلوية.

يرتبط الجسم النانوي المضاد ل GFP بالبروتين السطحي الموسوم ب GFP ويتم خلطه في حويصلة. تنقل هذه الحويصلة مركب البروتين السطحي للجسم النانوي على طول مسارات محددة داخل الخلايا ، بما في ذلك شبكة عبر جولجي ، أو TGN.

داخل TGN ، ينقل السلفوترانسفيراز في وجود ركيزة الكبريتات المشعة إلى بقايا تيروزين محددة على الجسم النانوي ، وبالتالي وضع العلامات الإشعاعية عليها.

اغسل الخلايا. بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا.

جهاز الطرد المركزي المحلل لإزالة الحطام الخلوي الكبير. عزل الأجسام النانوية باستخدام طريقة تنقية تعتمد على حبة النيكل.

قم بتحميل الجزء المعزول على هلام SDS-PAGE لفصل الجسم النانوي المصنف بالإشعاع إلى نطاقات متميزة.

أخضع الجل للتصوير الشعاعي الذاتي.

يكشف التصوير الشعاعي الناتج عن مناطق مظلمة ، مما يشير إلى وجود الجسم النانوي المسمى بالإشعاع.

في غطاء زراعة الخلايا ، قم بزرع ما بين 400,000 و 500,000 خلية HeLa التي تعبر بثبات عن بروتين مراسل موسوم ب GFP إما في أطباق 35 مم