اختبار لقياس البلعمة بوساطة الأجسام المضادة لكريات الدم الحمراء المصابة بالطفيليات

خذ كريات الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية. قم بتسمية الحمض النووي للطفيلي بصبغة فلورية لتصور الطفيليات.

احتضان هذه كريات الدم الحمراء المصابة بالطفيليات بأمصال الأفراد المعرضين للملاريا. تعرض هذه الخلايا مستضدات طفيلية على سطحها ، والتي ترتبط بالأجسام المضادة IgG البشرية المكتسبة بشكل طبيعي في المصل ، مما يؤدي إلى تضليل الخلايا للبلعمة.

انقل كريات الدم الحمراء المصابة بالطفيليات المعاكسة إلى صفيحة متعددة الآبار مغلفة بالبروتين تحتوي على معلق من الخلايا الوحيدة المشتقة من الإنسان - أو الخلايا البلعمة.

أثناء الحضانة ، تتفاعل مستقبلات Fc-gamma على الخلايا الوحيدة مع كريات الدم الحمراء IgG-opsonized ، مما يؤدي إلى ابتلاع كريات الدم الحمراء في البلعمة.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة لمنع المزيد من التفاعلات الخلوية ووقف البلعمة.

تخلص من المادة الطافية. يعالج بمحلول تحلل كلوريد الأمونيوم ، مما يؤدي إلى تمزق كريات الدم الحمراء المصابة غير البلعمة بشكل انتقائي دون التأثير على الخلايا الوحيدة.

أضف المخزن المؤقت المحتوي على المصل لإيقاف عملية التحلل. جهاز طرد مركزي وتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على كريات الدم الحمراء المحللة.

أعد تعليق الخلايا الوحيدة في مخزن مؤقت.

قم بإجراء قياس التدفق الخلوي لتحديد الخلايا الوحيدة التي تظهر التألق من كريات الدم الحمراء المصابة بالطفيليات بداخلها ، مما يؤكد البلعمة بوساطة الأجسام المضادة.

اضبط معلق كريات الدم الحمراء المصاب المنقى بمقدار 3.3 أضعاف 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر في وسط زراعة الطفيليات الذي يحتوي على بروميد الإيثيديوم إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول المنع من لوحة واحدة مكونة من 96 بئرا عن طريق تحريك اللوحة في حاوية نفايات. بعد ذلك ، قم بإزالة أي فائض فوق منشفة ورقية ، وأضف 30 ميكرولترا من ملصق بروميد الإيثيديوم المصاب بتعليق كريات الدم الحمراء إلى جميع البئر باستثناء بئر واحد في النصف العلوي من اللوحة. أضف 30 ميكرولترا من وسط زراعة الطفيليات إلى البئر الفارغ ، واحتضن الطبق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محميا من الضوء.

في نهاية الحضانة ، أضف 170 ميكرولترا من وسط زراعة الطفيليات إلى كل بئر ، وقم بترسيب كريات الدم الحمراء المصابة في قاع الصفيحة عن طريق الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق تحريك اللوحة في حاوية نفايات ، واغسل كريات الدم الحمراء المصابة ببروميد الإيثيديوم مرتين أخريين باستخدام 200 ميكرولتر من وسط زراعة الطفيليات لكل بئر ، كما هو موضح للتو.

بعد الغسيل الثاني، استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة الحجم الكامل للمادة الطافية بعناية من كل بئر، دون إزعاج الكريات، وإعادة تعليق كريات الدم الحمراء المصابة ببروميد الإيثيديوم في 30 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة، بما في ذلك الضوابط المناسبة وعينات الاختبار المعدة مسبقا في وسط زراعة الطفيليات. ثم ضع الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ، محميا من الضوء.

أثناء إجراء مضادة للكريات الحمراء المصابة ، اجمع خلايا THP-1 عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 12 مل من وسط زراعة خلايا THP-1 الطازج الدافئ مسبقا.

بعد الطرد المركزي الثاني ، قم بتعليق الحبيبات في 1 مليلتر من وسط زراعة الخلايا THP-1 للعد ، واضبط تركيز الخلية إلى 5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر في وسط زراعة الخلايا THP-1. قم بإزالة محلول المنع من اللوحة الثانية المكونة من 96 بئرا ، وأضف 100 ميكرولتر من خلايا THP-1 إلى كل بئر. ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا.

في نهاية حضانة التظليل ، أضف 170 ميكرولترا من وسط زراعة الطفيليات إلى كل بئر من لوحة التظليل ، وقم بترسيب كريات الدم الحمراء المصابة في قاع اللوحة عن طريق الطرد المركزي. اغسل كريات الدم الحمراء المصابة بالعدوى مرتين ب 200 ميكرولتر من وسط زراعة الطفيليات لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات لإزالة المادة الطافية بعناية بعد الغسيل الثاني.

قم بتعليق كريات الدم الحمراء المصابة في 100 ميكرولتر من وسط زراعة خلايا THP-1 الدافئ مسبقا لكل بئر ، ونقل 50 ميكرولترا من كل معلق كريات الدم الحمراء المصاب إلى بئر مقابل في لوحة البلعمة. عند إضافة جميع الخلايا ، ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة لا تزيد عن 40 دقيقة ، محمية من الضوء.

في نهاية الحضانة ، أوقف البلعمة عن طريق الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الكريات ب 150 ميكرولتر من محلول تحلل كلوريد الأمونيوم بدرجة حرارة الغرفة لكل بئر. بعد ثلاث دقائق بالضبط ، أضف 100 ميكرولتر من FBS المثلج البارد بنسبة 2٪ في PBS لإيقاف التحلل ، وترسيب الخلايا السليمة عن طريق الطرد المركزي.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من المثلج الطازج البارد 2٪ FBS في PBS ، لكل بئر ، لكل غسلة. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من الثلج الطازج البارد 2٪ FBS في PBS لكل بئر.

للحصول على قياس التدفق الخلوي وتحليله ، قم بتحميل الخلايا على الفور على مقياس التدفق الخلوي ، واستخدم مخطط التشتت الجانبي الخطي مقابل الخطي للآبار التي لا تحتوي على كريات الدم الحمراء المصابة لبوابة خلايا THP-1. احصل على 10,000 حدث في هذه البوابة ، واستخدم خلايا THP-1 مع كريات الدم الحمراء المصابة مع التحكم الإيجابي لإعداد مخطط رسم بياني لقياس شدة مضان بروميد الإيثيديوم.

للتحليل ، افتح مخطط التشتت الجانبي الخطي للأمام مقابل الخطي للآبار التي لا تحتوي على كريات الدم الحمراء المصابة ، وقم ببوابة خلايا THP-1. بعد ذلك ، قم بإعداد بوابة موجبة في الرسم البياني FL3 ، وانسخ هذه البوابات على جميع آبار العينات الأخرى لتحديد النسبة المئوية لخلايا THP-1 الإيجابية لبروميد الإيثيديوم.