اختبار في المختبر لقياس نشاط بروتياز العدلات سيرين باستخدام مبلغ الفلورسنت

خذ صفيحة دقيقة تحتوي على بروتياز سيرين العدلات أو NSPs. تعمل هذه الإنزيمات القابلة للذوبان ذات النشاط المحلل للبروتين ، والتي تفرزها العدلات ، في الاستجابات الالتهابية.

أضف مجسات مراسل الفلورسنت التي تحمل فكرة التعرف التي تعمل كموقع انقسام ل NSPs. يتم اقتران المجسات مع متبرع وفلوروفور متقبل.

عند الإثارة بطول موجي معين ، ينبعث الفلوروفور المانح من الطاقة. نظرا لقربه من المتبرع ، يمتص الفلوروفور المتقبل الطاقة وينبعث منه مضان بطول موجي مختلف.

الكشف عن إشارات المتبرع والمستقبل بشكل منفصل وحساب نسبة المتبرع إلى المستقبل لتقييم نشاط NSP. تشير النسبة المنخفضة إلى تبريد مضان المتبرع في حالة عدم وجود انقسام المسبار.

يتعرف NSPs على فكرة التعرف على المجسات وتشققها ، مما يؤدي إلى إطلاق المقبول.

تتيح المسافة من المستقبل انبعاث التألق من فلوروفور المتبرع ، مما يزيد من نسبة المتبرع إلى المستقبل. تشير النسبة العالية إلى انقسام المسبار الفعال من قبل NSPs.

قم بإذابة الإنزيمات على الجليد ، وقم بإعداد منحنى قياسي للإنزيم كما هو موضح في المخطوطة النصية. بالتوازي مع المستحضر القياسي ، قم بتخفيف عينات البلغم في مخزن التنشيط. على قارئ اللوحة ، اضبط الطول الموجي للإثارة لمسبار NEmo-1 NEmo-1 على 354 نانومتر والطول الموجي للانبعاث على 400 نانومتر للمتبرع و 490 نانومتر للمتقبل.

بالنسبة لمسبار CG FRET sSAM ، اضبط الطول الموجي للإثارة على 405 نانومتر ، والانبعاث على 485 نانومتر للمتبرع ، و 580 نانومتر للمستقبل. أضف 40 ميكرولترا من العينات أو المعايير أو الفراغات في آبار صفيحة نصف مساحة سوداء مكونة من 96 بئرا وأضف المزيج الرئيسي.

ابدأ قارئ اللوحة ، وسجل زيادة نسبة المتبرع إلى المستقبل بعد كل 60 إلى 90 ثانية لمدة 20 دقيقة على الأقل أو حتى تصل الزيادة في الإشارة إلى هضبة. تصدير البيانات وحساب نسبة المتبرع إلى المتقبل بقسمة RFU للمتبرع على RFU للقبول لكل نقطة زمنية وعينة. ثم احسب متوسط نسبة المتبرع إلى المتقبل والانحراف المعياري. تحديد الميل ضمن النمو الخطي لتغير نسبة المانح إلى المتقبل.