موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 5:04 دقيقة • July 8th, 2025
خذ مجموعتين من الخلايا التائية CD8 +: الخلايا التائية المستجيبة CD8 + التي تم تنشيطها مسبقا من خلال المشاركة بوساطة الأجسام المضادة للخلايا التائية والمستقبلات التحفيزية المشتركة وخلايا CD8 + T المكبوتة التي تثبطها الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع.
أضف هذه الخلايا التائية إلى الآبار المطلية بالغشاء القاعدي مع الخلايا السرطانية التي تعبر عن بروتين فلوري مقيد نوويا.
الماصة ، وهي ركيزة كاسباز 3 فلورية - صبغة فلوروجينية مرتبطة بالحمض النووي مترافقة مع ببتيد يحتوي على موقع التعرف على الكاسباز -3.
حضن. ترتبط مستقبلات الخلايا التائية المستجيبة بمركب ببتيد معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى على الخلايا السرطانية ، مما يؤدي إلى إطلاق حبيبات سامة للخلايا تحتوي على البيرفورينات والجرانزيم.
تخلق البرفورينات مسام غشاء الخلايا السرطانية ، مما يسمح بدخول الجرانزيم وتنشيط الكاسباز ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج.
بالإضافة إلى ذلك ، تشق الكاسباسات المنشطة ركيزة الكاسباز الفلوروجينيك ، وتطلق الصبغة التي ترتبط بالحمض النووي والفلوريس.
تحت المجهر الفلوري ، تظهر الخلايا السرطانية المزروعة بالاشتراك مع الخلايا التائية المستجيبة مضان نووي مزدوج ، مما يشير إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية.
في المقابل ، تظهر الخلايا السرطانية المزروعة بشكل مشترك مع الخلايا التائية المكبوتة مضان البروتين النووي فقط ، مما يشير إلى خلايا غير موت الخلايا المبرمجة.
لإعداد زراعة مشتركة للخلية التائية المستهدفة CD8 الموجبة مسبقا ، أولا ، أضف 30 ميكرولترا من 1 إلى 100 مصفوفة غشاء القاع المخفف المخفف إلى الآبار المناسبة للوحة مسطحة القاع ذات 96 بئرا مناسبة للفحص المجهري. رج اللوحة لنشر المصفوفة بالتساوي ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعة واحدة على الأقل. أثناء توازن اللوحة ، قم بإعداد الخلايا المستهدفة. قم بشفط الوسط ، واغسله باستخدام PBS ، وأضف 1 مليلتر من 0.05٪ تريبسين-EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
أضف 9 ملليلتر من DMEM المكمل بمصل الأبقار الجنينية عن طريق الماصة اللطيفة ، وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنابيب. بعد الطرد المركزي للخلايا ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من EDMEM. قم بتصفية الخلايا المعلقة من خلال مصفاة خلية ، وعد الخلايا الحية. بعد ذلك ، اضبط الكثافة إلى 4 في 10 إلى الخلايا المستهدفة الرابعة لكل مليلتر في EDMEM الطازج على الجليد.
بعد ذلك ، قم بعمل ماصة الخلايا التائية الإيجابية CD8 المنشطة مسبقا عدة مرات لإعادة تعليق الخلايا في معلق أحادي الخلية ، ونقل الخلايا التائية العائمة إلى أنبوب واحد سعة 1.5 مليلتر لكل حالة. اجمع أي خلايا متبقية تحتوي على 200 ميكرولتر من PBS لكل بئر ، وانقل الغسالات إلى أنابيب 1.5 ملليلتر المناسبة ، وأجهزة الطرد المركزي. استنشق الوسط ، وأضف 1 مليلتر من EDMEM إلى كل أنبوب للطرد المركزي.
بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من EDMEM الطازج لكل أنبوب. بعد العد ، اضبط الخلايا في كل أنبوب على كثافة 1.6 في 10 إلى الخلايا التائية الخامسة المفعلة مسبقا CD8 لكل مليلتر من الوسط ، وضع الخلايا على الجليد. عندما تكون الخلايا جاهزة ، قم بسحب مصفوفة الغشاء القاعدي من كل بئر من لوحة الفحص المجهري المكونة من 96 بئرا ، وأضف 50 ميكرولترا من الخلايا المستهدفة إلى الآبار الفردية داخل 60 بئرا داخليا من اللوحة مع الخلط.
أضف 25 ميكرولترا من EDMEM مكملا ب 4 أضعاف 10 إلى الوحدات الثالثة لكل مليلتر من IL-2 ، و 10 ركيزة كاسباز فلوروجينيك ميكرومولار إلى الآبار المناسبة. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من الخلايا التائية الموجبة CD8 المنشطة مسبقا إلى الآبار المناسبة ، وأخيرا ، أضف EDMEM إلى الآبار المناسبة ليصبح الحجم الإجمالي يصل إلى 100 ميكرولتر. أضف 200 ميكرولتر من PBS أو الماء المعقم في جميع الآبار الفارغة ، ورج اللوحة ، واترك الطبق على سطح مستو لمدة 10 دقائق.
لتصوير الخلايا ، اضبط المجهر للحصول على صور في تباين الطور ، بالإضافة إلى قنوات الفلورسنت المناسبة لبروتين الفلورسنت المقيد نوويا ، والفلوروفورات الركيزة المنشطة بالفلوروجين كاسباز -3 المستخدمة في التجربة. بعد ذلك ، التقط صورا لكل بئر تجريبي في تباين الطور ، وقناتا الفلورسنت كل ساعة إلى ثلاث ساعات لمدة 72 ساعة على الأقل.