فحص متعدد الإرسال قائم على الخرزة لتحليل السيتوكينات في عينات الدموع البشرية

أضف عينات المسيل للدموع البشرية وكوكتيل حبة الأجسام المضادة إلى لوحة فحص مغسولة.

ترتبط الأجسام المضادة بخرز مغناطيسي مرمز بالألوان ، مشربة بنسب متفاوتة من الفلوروفورات المقابلة للتوقيعات الطيفية المميزة ، مما يسهل اكتشاف السيتوكين المتعدد.

ترتبط السيتوكينات المسيلة للدموع بالأجسام المضادة الملتقطة المرتبطة بالخرزة.

باستخدام غسالة اللوحة المغناطيسية ، قم بتسوية مجمعات حبة الأجسام المضادة. باستخدام المخزن المؤقت ، قم بإزالة الجزيئات الحيوية غير المرتبطة.

أضف الأجسام المضادة للكشف عن البيوتينيل التي ترتبط بالسيتوكينات المقلدة.

ماصة ستربتافيدين-فيكوريثرن مترافقة, الذي يرتبط بالأجسام المضادة البيوتينيل.

باستخدام غسالة اللوحة ، قم بإزالة محتويات البئر غير المقيدة. أعد تعليق المجمعات المرتبطة بالسيتوكين في سائل الغمد.

أثناء تحليل العينة ، ينقل النظام السائل مجمعات الخرز إلى مجموعة البصريات.

ينشط الليزر الأول أصباغ الخرز الداخلية ، مع تحديد الإشارة الناتجة للسيتوكينات المحددة.

ينشط الليزر الثاني جزيء المراسل المرتبط بمركب الخرزة ، الذي تمثل شدة إشارته تركيز السيتوكين ، مما يتيح القياس الكمي المتزامن للسيتوكينات المتعددة.

لإجراء مقايسة تعدد الإرسال القائم على الخرزة ، قم بإحضار جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة ، وقم بدوامها لمدة خمس إلى 10 ثوان. إذا تم تخزين عينات المسيل للدموع عند 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل الفحص ، فقم بإذابة المستخلصات المسيلة للدموع المجمدة على الجليد ، وقم بالطرد المركزي للعينات عند 1,000 مرة جم لمدة خمس دقائق. قم بإعداد ورقة عمل الفحص في تكوين رأسي لمعايير السيتوكين البشرية العاملة QC-1 و QC-2 والعينات.

أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1x إلى كل بئر من اللوحة ، وأغلقه باستخدام مادة مانعة للتسرب من الألواح. ثم احتضن الطبق على شاكر طبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بصب المخزن المؤقت للغسيل 1x عن طريق قلب اللوحة ، واضغط عليه على المناشف الماصة عدة مرات لإزالة أي كمية متبقية من مخزن الغسيل في الآبار.

بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من كل معيار سيتوكين بشري عامل QC-1 و QC-2 والفراغ مع مخزن مؤقت للفحص والعينات فقط في الآبار المناسبة. أضف 25 ميكرولترا من مخزن الفحص المؤقت في كل بئر. ثم أضف إلى الآبار 25 ميكرولترا من محلول كوكتيل حبة الأجسام المضادة 1x.

نظرا لأن محلول حبة الأجسام المضادة حساس للضوء ، فقم بإغلاق اللوحة وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم وغطاء اللوحة للحماية من الضوء أثناء الفحص. احتضن الطبق عند أربع درجات مئوية على شاكر طوال الليل. في اليوم التالي ، ضع اللوحة على رف اللوحة لغسالة اللوحة المغناطيسية الأوتوماتيكية ، واتركها لمدة دقيقة واحدة لتسوية الخرز المغناطيسي في قاع البئر.

قم بشفط محتويات البئر ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر باستخدام غسالة اللوحة المغناطيسية الأوتوماتيكية. دع الطبق يجلس لمدة دقيقة واحدة ، ثم استنشق محتويات البئر كما كان من قبل ، وكرر الغسيل مرة أخرى. أضف 25 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة للكشف في كل بئر. أغلق اللوحة ، وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم وغطاء اللوحة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من محلول الستربتافيدين فيكوريثرن في كل بئر ، وبعد إغلاق اللوحة وتغطيتها ، احتضن في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، ضع اللوحة على غسالة لوحة مغناطيسية ، واتركها لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بشفط محتويات البئر وأضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل لكل بئر. اتركه لمدة دقيقة واحدة ، ثم استنشق محتويات البئر قبل تكرار الغسيل مرة أخرى. أضف 150 ميكرولترا من سائل الغمد إلى كل بئر. بعد ذلك ، ضع اللوحة على شاكر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لإعادة تعليق حبات الأجسام المضادة قبل الشروع في قراءة اللوحة وتحليل تركيزات السيتوكين.