استخدام مضان الحمض النووي الريبي المناعي في الموقع لتصور SARS-CoV-2

خذ خلايا فيرو الثابتة والمتنفذة المصابة بفيروس كورونا - وهي سلسلة خلايا ثدييات تعاني من نقص الإنترفيرون.

داخل المضيف ، يوجد الحمض النووي الريبي الفيروسي على شكل جزيئات الحمض النووي الريبي الفرعي أو sgRNAs ، وهي جزيئات الحمض النووي الريبي متوسطة الطول تشفر بروتينات فيروسية معينة يتم تصنيعها عن طريق النسخ.

أضف تفاعل التهجين المتسلسل أو مجسات بادئ HCR.

يرتبط مسبار HCR بتسلسله التكميلي على الحمض النووي الريبي المستهدف.

إدخال مجسات دبوس شعر قليل النوكليوتيد المسمى بالفلورسنت ، H-1 و H-2.

يرتبط مسبار البادئ بذيله H1 التكميلي ، مما يؤدي إلى خطية هيكل دبوس الشعر.

يرتبط تسلسل H1 المكشوف بذيله H2 التكميلي.

يستمر تسلسل H2 الزائدة في الارتباط بذيل H1 ، مما يؤدي إلى تضخيم المجسات ذات العلامات الفلورية حول المنطقة المستهدفة ، وتوليد إشارة قوية.

أضف أجساما مضادة مناسبة لتصور الهيكل الخلوي للخلية المضيفة.

تلطيخ النوى باستخدام DAPI.

تحت المجهر الفلوري ، تظهر الخلايا المصابة بالفيروس تألق أحمر في السيتوبلازم ، مما يشير إلى وجود الحمض النووي الريبي المستهدف.

بعد تثبيت الخلايا ونفاذيتها ، كما هو موضح في المخطوطة النصية ، قم بإزالة محلول 1x PBS من الآبار ، وأضف ما لا يقل عن 300 ميكرولتر من مخزن التضخيم إلى كل بئر. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد كل دبوس شعر HCR عن طريق تبريد الحجم المطلوب في أنابيب منفصلة.

لتحضير 300 ميكرولتر من محلول التضخيم ، استخدم 18 بيكامول من كل دبوس شعر. انقل محلول دبوس الشعر إلى أنابيب ، واحتضنها عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. قم بإعداد خليط دبوس الشعر عن طريق إضافة دبابيس الشعر H1 و H2 المبردة بشكل سريع إلى المخزن المؤقت للتضخيم. ضع قطرات من 30 إلى 50 ميكرولترا من خليط دبوس الشعر على البارافيلم ، واحتضن العينات طوال الليل في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

لتركيب الشرائح ، ضع قطرتين سعة 10 ميكرولتر من وسط التثبيت على شريحة ، مع التأكد من فصل القطرات بشكل كاف للسماح بوضع غطاءين على شريحة واحدة. قم بإزالة السوائل الزائدة عن طريق النقر على أغطية منشفة نظيفة. ثم ضعها في وسط تركيب مضاد للبهتان بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل. ضع العينات المركبة على سطح مستو جاف في الظلام واتركها تلتئم.