اختبار تحييد دقيق لقياس عيار الأجسام المضادة المعادلة في المصل البشري

لاختبار التحييد الدقيق ، خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على مصل بشري معطل بالحرارة ومخفف بشكل متسلسل مع تركيزات متناقصة من الأجسام المضادة المعادلة الخاصة بالإنفلونزا.

إدخال فيروسات الأنفلونزا المسببة للأمراض. تتفاعل الأجسام المضادة في الدم مع الفيروسات وتحييدها. ومع ذلك ، فإن تخفيفات المصل الأعلى تظهر تحييدا محدودا للفيروس.

البذور مع خلايا الكلى Madine-Darby ، أو خلايا MDCK ، تفرط في التعبير عن بقايا حمض السياليك البشري على سطحها.

في التخفيف العالي ، تندمج فيروسات الأنفلونزا غير المعادلة مع حمض السياليك للخلايا ، وتطلق الجينوم الفيروسي في سيتوبلازم الخلية.

يتم نسخ الجينات الفيروسية وترجمتها إلى بروتينات فيروسية وبروتينات نووية داخل الخلية المضيفة.

يعالج بتركيز عال من الأسيتون للتثبيت والنفاذية.

إدخال الأجسام المضادة الأولية التي تتفاعل مع البروتينات النووية الفيروسية.

تراكب مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالإنزيم التي تتفاعل مع الأجسام المضادة الأولية. اغسل وعالج بركيزة الإنزيم ، مما ينتج عنه منتج ملون.

حدد كثافة اللون ورسمها مقابل تخفيف المصل ؛ أعلى تخفيف للمصل ، تحقيق تحييد للفيروس بنسبة خمسين بالمائة يمثل عيار التحييد.

في اليوم الأول من فحص MN ، قم بإذابة المصل في حمام مائي 37 درجة مئوية ، ثم قم بإزالته مباشرة بعد الذوبان. قم بتعطيل السيل البشري بالحرارة لمدة 30 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 56 درجة مئوية ، كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم ضع المصل على الثلج ، وأضف مخفف الفيروس إلى المصل لتحقيق 1 إلى 10 تخفيف مسبق.

للاختبار باستخدام فيروس واحد ، أضف 50 ميكرولترا من مخفف الفيروس إلى الصفوف من B إلى H ، باستثناء العمودين 11 و 12. ثم أضف 100 ميكرولتر من 1 من 10 مصل مخفف إلى الأعمدة A1 إلى A10. قم بإجراء تخفيف تسلسلي مزدوج من الصفوف من A إلى H ، وتخلص من آخر 50 ميكرولترا في الصف H.

لمكافحة الفيروس ، أضف 50 ميكرولترا من مخفف الفيروس إلى الآبار A12 و B12 و C12 و D12. للتحكم في الخلية ، أضف 100 ميكرولتر من مخفف الفيروس إلى الآبار E12 و F12 و G12 و H12. بالنسبة لمصل التحكم ، أضف 100 ميكرولتر من مصل التحكم المخفف إلى البئر A ، العمود 11 ، وأضف 50 ميكرولترا من مخفف الفيروس إلى الآبار B11 إلى H11. استمر في التخفيف بشكل متسلسل. غطي الأطباق واحتضنها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، حتى تصبح جاهزة لإضافة الفيروس.

لإضافة الفيروس ، قم بتخفيف الفيروس إلى 100 TCID50 في 50 ميكرولتر مع مخفف للفيروسات. أضف 50 ميكرولترا من الفيروس المخفف إلى جميع الآبار، باستثناء العمود 11 على ألواح المعايرة بالتحليل الحجمي الخلفية، وآبار التحكم في الخلايا E12 وF12 وG12 وH12 على جميع الألواح. أضف 50 ميكرولترا من مخفف الفيروس إلى جميع الآبار في العمود 11. ثم أضف 50 ميكرولترا من الفيروس عند 100 TCID50 في 50 ميكرولترا إلى البئر الأول.

بعد ذلك ، قم بخلط ونقل 50 ميكرولترا إلى آبار متتالية لإجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة. قم بتغيير أطراف الماصة بين الآبار لتجنب ترحيل الفيروس. تخلص من 50 ميكرولتر من البئر H11 ، ثم أضف 50 ميكرولترا من مخفف الفيروس إلى العمود 11 ليصل الحجم النهائي إلى 100 ميكرولتر. اضغط على اللوحات للخلط. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة قبل إجراء إضافة خلايا MDCK في اليوم الأول و ELISA في اليوم الثاني كما كان من قبل.

بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإجراء إضافة الركيزة وقراءة اللوحة. اغسل الأطباق خمس مرات باستخدام 300 ميكرولتر من محلول الغسيل واضغط على منديل خال من النسالة. أضف 100 ميكرولتر من ركيزة العيادات الخارجية المعدة حديثا إلى كل بئر. بعد ذلك ، قم باحتضان الصفائح في درجة حرارة الغرفة حتى تصل آبار التحكم في الفيروس إلى كثافة بصرية عند 490 نانومتر بين 0.8 إلى 3 ، مع التحكم في الخلية في خلفية منخفضة OD أقل من 0.2. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف إلى جميع الآبار.

اقرأ OD للآبار عند 490 نانومتر ، باستخدام مقياس الطيف الضوئي المجهري. أخيرا ، حدد عيار الأجسام المضادة المعادلة لكل عينة من عينات المصل ، كما هو موضح في بروتوكول النص.