اختبار للكشف عن الانفجار التأكسدي في أقراص أوراق نبات الأرابيدوبسيس عند استنباط المناعة

الحصول على أقراص أوراق نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا. اغمرها في آبار صفيحة دقيقة تحتوي على ماء مقطر مزدوج لمنع الجفاف.

احتضان الأقراص للسماح بالتعافي من الجرح.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الماء. أضف خليط تفاعل يحتوي على الببتيدات المشتقة من البكتيريا وإنزيم بيروكسيداز الفجل واللومينول.

باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس اللمعان بمرور الوقت.

تربط مستقبلات التعرف على الأنماط ، أو PRRs ، على الخلايا النباتية ، الببتيدات البكتيرية ، وهي أنماط جزيئية مرتبطة بالميكروب.

علاوة على ذلك ، يرتبط PRR بمستقبله المشترك ، ويخضع للفسفرة المتبادلة ، وينشط كينازات البروتين الشبيهة بالمستقبلات ، ويتسبب في تدفق الكالسيوم داخل الخلايا.

وهذا بدوره ينشط متماثل أوكسيديز الانفجار التنفسي عبر الغشاء ، أو بروتينات RBOH.

يحفز RBOH المنشط إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية خارج الخلية ، أو ROS ، مما يتسبب في انفجار مؤكسد. علاوة على ذلك ، يتم تحويل ROS إلى بيروكسيد الهيدروجين.

بيروكسيداز الفجل بيروكسيداز الهيدروجين لأكسدة اللومين في حالة إثارة ، مما ينبعث منه لمعان عند العودة إلى الحالة الأرضية.

قم بقياس اللمعان لمراقبة الانفجار التأكسدي السريع بعد التعرف على النمط الميكروبي.

بعد 4 إلى 5 أسابيع من الإنبات ، استخدم ثقب خزعة حاد بطول 4 ملم لإزالة قرص ورقة واحد لكل نبات نبات الأرابيدوبسيس ، وتجنب منتصف الوريد والحرص على الحد من الجرح. اجمع الأقراص في آبار فردية للوحة مقياس الإنارة غير المستخدمة المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لكل بئر على الجانب المحوري لأعلى لمنع الجفاف.

في حالة تقييم العديد من المحفزات ، قم بإزالة قرص ورقة ثان من نفس الورقة لكل معالجة محفزة ، وقم بتغطية اللوحة بالغطاء للسماح لأقراص الأوراق بالتعافي طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في صباح اليوم التالي ، اضبط معلمات قارئ الصفيحة الدقيقة على وقت تكامل يبلغ 1,000 مللي ثانية على فترات مدتها دقيقتان على مدى 40 إلى 60 دقيقة لالتقاط الانفجار التأكسدي الديناميكي.

بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لاستبدال الماء في كل بئر ب 100 ميكرولتر من محلول التفاعل المحضر حديثا، بما في ذلك تفاعل التحكم بدون محفز لكل نمط وراثي لتقييم مستويات أنواع الأكسجين في التفاعل القاعدي في حالة عدم وجود استنباث. ثم ، على الفور ، قم بقياس انبعاث الضوء لجميع الأطوال الموجية في الطيف المرئي على قارئ الصفيحة الدقيقة.