مقايسة للكشف عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في أنسجة الأرز عند الاستنباط المناعي

خذ صفيحة دقيقة تحتوي على شرائح غمد موحدة مقطوعة من شتلات الأرز وأقراص الأوراق التي تم الحصول عليها من أوراق نبات الأرز.

أضف الماء المعقم واحتضنه طوال الليل للسماح بالتعافي من إجهاد الجرح.

أضف ببتيد مناعي مشتق من السوط البكتيري الذي يعمل كنمط جزيئي مرتبط بالعامل الممرض أو PAMP.

ترتبط الخلايا النباتية عند الحواف المقطوعة ب PAMPs عبر مستقبلات التعرف على الأنماط.

يؤدي

الارتباط إلى تشغيل إشارات المصب ، مما يؤدي إلى تنشيط إنزيم موضعي لغشاء البلازما يسمى متماثل أوكسيديز الانفجار التنفسي أو RBOH.

ينتج RBOH المنشط أنواع الأكسجين التفاعلية أو ROS في الأابوبلاست - الفضاء بين الخلايا. يتم تحويل ROS المنتج إلى بيروكسيد الهيدروجين.

أضف إنزيم بيروكسيداز وركيزة

كيميائية. يستخدم

بيروكسيداز بيروكسيداز الهيدروجين لتحويل الركيزة إلى حالة وسيطة مثارة ، والتي تطلق الطاقة كضوء وتعود إلى الحالة الأرضية.

قم بقياس اللمعان في كلا النوعين من الأنسجة للكشف عن الزيادة الحادة مباشرة بعد علاج PAMP ، مما يشير إلى انفجار ROS.

قم بتقطيع الغمد من شتلات الأرز التي يبلغ عمرها 10 أيام إلى شرائح بحجم 3 ملم بشفرة حلاقة حادة أو شفرة جراحية للمعالجة المسبقة قبل يوم واحد من اختبار ROS. ضع 5 أجزاء غمد في بئر فردي من صفيحة ميكروتيتر مكونة من 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لمدة 10 إلى 12 ساعة.

قم بقص أقراص الأوراق من نباتات الأرز التي يبلغ عمرها أربعة إلى ستة أسابيع باستخدام خزعة باستخدام مكبس. قم دائما بقص أقراص الأوراق من الثلث الأوسط من الورقة الثانية من الحارث الرئيسي لتقليل تباين البيانات. بعد ذلك ، ضع قرصا ورقيا واحدا في بئر فردي من صفيحة ميكروتيتر مكونة من 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لمدة 10 إلى 12 ساعة للمعالجة المسبقة. حافظ على جميع أقراص الأوراق تطفو ومتجهة لأعلى في آبار صفيحة ميكروتيتر للمعالجة المسبقة للمياه لتجنب التباين المرتبط بجانب الأوراق.

قم بإعداد محلول الاستنباط عن طريق الجمع بين 9.4 مل من 50 ميكرومولار تريس حمض الهيدروكلوريك ، و 400 ميكرولتر من محلول L-012 ، و 100 ميكرولتر من بيروكسيداز الفجل الحار ، و 100 ميكرولتر من flg22. أضف 200 ميكرولتر من محلول الاستنباط إلى الآبار.

ابدأ تشغيل البرنامج ، وانقر فوق الزر "التجارب" لإنشاء بروتوكول جديد أو استخدام بروتوكول موجود. انقر فوق الإجراء في النافذة المنبثقة لإعداد اللوحة وتحديد الآبار من اللوحة المراد مراقبتها. انقر فوق Start Kinetic، واضبط وقت التشغيل على 30 دقيقة أو أكثر، وفقا للمتطلبات التجريبية. حدد الحد الأدنى للفاصل الزمني للحصول على القراءات بشكل متكرر قدر الإمكان ، وبالنسبة لوقت التكامل ، اختر ثانية واحدة أو أكثر ، اعتمادا على شدة الإشارة.

انقر فوق التحقق من الصحة متبوعا بموافق لتأكيد الإعدادات. ثم انقر فوق اكتشاف لوحة جديدة في النافذة المنبثقة وانتظر حتى يطالب البرنامج بمربع حوار لوحة التحميل. قم بإزالة الماء المقطر المزدوج بعناية من الآبار التي تحتوي على الأنسجة المعالجة مسبقا ، وتجنب أي تلف أو جفاف للأنسجة. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 200 ميكرولتر من محلول الاستنباط إلى الآبار التي تحتوي على الأنسجة. ضع اللوحة المراد اختبارها على الناقل ، وابدأ في الكشف.