قياس الجاذبية في مجموعة مختلطة من الخلايا التائية

ابدأ بلوحة متعددة الآبار تحتوي على خلايا شجيرية للفأر ، أو DCs تحمل مستضدات خيفية أو متغيرات وراثية من المستضدات الذاتية.

إدخال الخلايا التائية للفأر ، بما في ذلك الخلايا التائية الحساسة غير المتفاعلة مع المستضدات الذاتية ، مع التعرف على المستضدات الغريبة.

تتعرف الخلايا التائية الحساسة على هذه المستضدات الخيفية وتتفاعل مع DCs ، مما يؤدي إلى إعادة ترتيب الهيكل الخلوي ، بما في ذلك إعادة تنظيم F-actin.

هذا يعزز المستقبلات الموجودة على الخلايا التائية للتفاعل مع جزيئات التحفيز المشترك على التيار المستمر ، مما يشكل اتصالا خلويا - مشبك مناعي.

قم بإصلاح الخلايا ، ونقلها إلى أنبوب ، وأدخل مزيجا من الأجسام المضادة المسماة بالفلوروكروم الخاصة بمستقبلات الخلايا التائية والتيار المستمر ، مما يضفي مضان مميز.

قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت يحتوي على عامل نفاذية يتخلل الخلايا وعلامات البروتين الخضراء الموسومة بالفلوروفور التي ترتبط ب F-actin.

جهاز الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت يحتوي على صبغة نووية ، مما يؤدي إلى تلطيخ النوى باللون الأحمر.

باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير ، حدد المزدوجات - المقابلة للخلية التائية واقترانات التيار المستمر مع الشعيرات المتصالبة الخضراء ل F-actin - مما يؤكد تكوين المشبك.

حدد الزوجيات التي تمثل درجة الجاذبية.

ابدأ بزرع 0.5 في 10 إلى الخلايا المتغصنة السادسة في كل بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا ، متبوعا ب 1 في 10 إلى الخلايا التائية السادسة في حجم نهائي يصل إلى 50 ميكرولتر من وسط الثقافة لكل بئر. احتضان المزارع الباردة لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

ثم أضف ثلاثة أضعاف حجم الثقافة البالغ 1.5٪ فورمالديهايد في PBS إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية التثبيت ، انقل الخلايا من كل بئر إلى أنبوب بوليسترين 5 ملليلتر ، وصمة عار في الخلايا بالأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم المناسبة في 100 ميكرولتر من عازلة الغسيل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا في 1 مليلتر من محلول الغسيل وأعد تعليق الكريات في محلول غسيل بيرم يحتوي على الفالويدين-FITC. بعد 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء ، اغسل الخلايا في 1 ملليلتر من محلول غسيل بيرم الطازج. أعد تعليق الكريات في الصبغة النووية ذات الأهمية في المخزن المؤقت للغسيل لمدة 30 دقيقة حضانة نهائية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء ، واغسل الخلايا في 1 ملليلتر من محلول غسيل بيرم ، متبوعا بغسل واحد في مخزن الغسيل وحده. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا في 50 إلى 100 ميكرولتر من محلول الغسيل الطازج ، وانقل الخلايا إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ذات الغطاء الصغير.

لتحليل التفاعلات من خلية إلى خلية ، أولا ، احتفظ بقناة واحدة للحصول على صورة المجال الساطع ، وقم بتحميل أنبوب التحكم الأول. مع إيقاف تشغيل قناة المجال الساطع، في نافذة مساحة العمل، قم بإنشاء مخطط مبعثر جديد لكل قناة مستخدمة مع نسبة العرض إلى الارتفاع فوق المنطقة، وقم ببوابة المفردات حيث تكون نسبة العرض إلى الارتفاع قريبة من واحد.

لكل فلوروكروم ، تحقق من المجموعة الإيجابية ، واضبط جهد الليزر في صندوق الإضاءة حسب الضرورة. في مربع القنوات، حدد القنوات المناسبة للفلوروكرومات المستخدمة في التلوين. ثم انقر فوق تسجيل. عندما يصل عدد الأحداث إلى الحد المحدد، سيتوقف الاكتساب تلقائيا.

بعد الحصول على جميع عناصر التحكم في البقع المفردة ، قم بتحميل أول أنبوب عينة تجريبي ، واحصل على عشرات الآلاف من الأحداث ضمن قنوات التحليل المناسبة ، بما في ذلك قناة المجال الساطع.