تحديد وتعداد الخلايا المناعية في سائل الغسيل القصبي السنخي عن طريق قياس التدفق الخلوي

ابدأ بلوحة متعددة الآبار تحتوي على سائل غسيل قصبي الفئران يتكون من خلايا مناعية ملطخة بصبغة حيوية فلورية خضراء.

إدخال الأجسام المضادة FC لمنع مستقبلات FC للخلايا المناعية.

أضف مزيجا من الأجسام المضادة المميزة التي تحمل علامة الفلوروفور التي تستهدف علامات خلوية معينة. قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت.

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، حدد المفردات الفلورية الخافتة ، مما يشير إلى الخلايا الحية.

تضيء الخلايا عند 488 نانومتر ، مما يتسبب في انبعاث الخلايا من التألق الأحمر المرتبط بالخلايا التي تعبر عن CD11c.

ضمن عدد السكان المرتفع CD11c ، مع مرشحات الطول الموجي المناسبة ، حدد بروتينات علامة الخلية MHC-II على الخلايا المتغصنة و SiglecF على الضامة.

في عدد السكان المنخفض CD11c ، يتيح التعبير عن CD3 على الخلايا التائية و CD19 على الخلايا البائية التعرف عليها.

تضيء الخلايا عند 405 نانومتر ، وتنبعث منها مضان أزرق ، مما يدل على العدلات التي تعبر عن CD11b.

تثير الخلايا المضيئة عند 633 نانومتر الفلوروفورات ذات اللون الأحمر البعيد على الحمضات التي تعبر عن Ly-6G.

باستخدام بيانات قياس التدفق الخلوي ، قم بتعداد وفرة كل نوع من الخلايا المناعية في سائل غسل القصبات الهوائية.

بعد مجموعة غسل القصبات الهوائية الثالثة ، قم بالطرد المركزي للشفط المجمع ، وقم بتخزين المادة الطافية عند سالب 80 درجة مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل ACC. بعد ما لا يزيد عن دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، قم بتخفيف المخزن المؤقت للتحلل بمليلتر واحد من PBS البارد وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب من PBS لعدد العينات المراد تحليلها وتقسيم الخلايا إلى العدد المناسب من الآبار من صفيحة 96 بئرا للتحليل. اجمع الخلايا عن طريق طرد مركزي آخر ، وأعد تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من كتلة FC في PBS.

بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف 50 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة المناسب محل الاهتمام لكل بئر ، واحتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة وتخلص من المادة الطافية ، وقم بتعليق الكريات إلى حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل بئر لتحليل التدفق الخلوي.