اختبار الفحم أجار ريزازورين لتقييم نشاط مركب الاختبار ضد البكتيريا الفطرية

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على البكتيريا الفطرية. أضف تركيزات مركب الاختبار المتزايدة إلى الآبار.

حضن. اعتمادا على عمل المركب على البكتيريا الفطرية ، يمكن أن يثبط نمو البكتيريا الفطرية ، أو يعرض نشاطا مضادا للجراثيم ، أو يقضي على البكتيريا الفطرية ، مما يدل على نشاط مبيد للجراثيم.

انقل كميات جيدة إلى مقايسة أجار الفحم ، أو CARA ، صفيحة دقيقة تحتوي على أجار مع الفحم المنشط لامتصاص مركب الاختبار ، مما يمنع تأثيرات الترحيل.

حضن. يمنع نشاط الجراثيم للمركب تكاثر البكتيريا الفطرية ، بينما يقلل نشاط مبيد الجراثيم من قابلية البقامرة الفطرية.

أضف عازلة ، ريزازورين ، وخافض للتوتر السطحي غير أيوني لتفريق الريزازورين في الآبار.

في البكتيريا الفطرية النشطة الأيضية ، تقلل نازعات الهيدروجين من ريزازورين الفلوري الأزرق اللون إلى ريسوروفين فلوري وردي.

باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس مضان الريسوروفين في الآبار.

تشير

الآبار التي تفتقر إلى مضان الريسوروفين إلى نشاط المركب المبيد للجراثيم.

تشير شدة التألق المتفاوتة عبر الآبار إلى الحمل البكتيري الحي ، مما يعكس الفاعلية المعتمدة على التركيز للجراثيم أو الجراثيم لمركبات الاختبار.

تلقيح أنابيب الطرد المركزي المستديرة القاع أو المخروطية البولي بروبيلين التي تحتوي على 4 أو 20 ملليلتر على التوالي من Middlebrook 7H9-ADN ، أو 7H9-OADC مع M. smegmatis عند OD₅₈₀ من 0.01 إلى 0.1. احتضان M. smegmatis المزارع عند 37 درجة مئوية و 20٪ O₂ مع الاهتزاز ، وتوسيع الثقافات إلى منتصف مرحلة السجل أو OD₅₈₀ التقريبي 0.5.

لإعداد الحد الأدنى من تجربة نمط التركيز المثبط في ظل ظروف النسخ المتماثل وغير المتماثل ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الخلايا في 7H9-ADN عند OD₅₈₀ من 0.01 في جميع آبار صفيحة 96 بئر المعالجة بثقافة الأنسجة ذات القاع الواضح.

بالنسبة للمقايسة غير المتماثلة ، استخدم PBS الذي يحتوي على 0.02٪ tyloxapol لغسل الخلايا مرتين واستخدام وسيط غير مكرر لإعادة تعليق الخلايا. استخدم وسيطا غير مكرر لتخفيف الخلايا إلى OD₅₈₀ من 0.1 ، وأضف نتريت الصوديوم إلى تركيز نهائي من 0.5 إلى 5 مللي مولار من مخزون 1 مولي طازج.

قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الخلايا عند OD₅₈₀ من 0.1 في جميع آبار صفيحة 96 بئرا معالجة بزراعة الأنسجة ذات القاع الشفاف. بعد تحضير عوامل الاختبار وفقا لبروتوكول النص ، أضف 2 ميكرولتر من عامل الاختبار # 1 في الصفوف من A إلى E ، و 2 ميكرولتر من عامل الاختبار # 2 في الصفوف من E إلى H ، واخلطها جيدا.

لتكرار المقايسات ، احتضان M. smegmatis الصفائح الدقيقة عند 37 درجة مئوية ، و 20٪ O₂ ، و 5٪ CO₂ لمدة 1 إلى 48 ساعة. في النقاط الزمنية التي سيتم فيها استخدام CARA كقراءة، استخدم ماصة P200 متعددة القنوات مضبوطة من 50 إلى 75 ميكرولترا لإعادة تعليق محتويات البئر في لوحة الفحص على غرار MIC90 بعناية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل من 5 إلى 10 مرات. بعد ذلك، استخدم أطراف الماصة لتحريك محتويات الآبار برفق بحركة دائرية.

انقل 10 ميكرولترات من محتويات بئر الفحص غير المخفف إلى الآبار المقابلة لصفيحة CARA الدقيقة ، وتجنب الرش أثناء عمليات النقل ، والتأكد من رصد حصة 10 ميكرولتر في منتصف آبار الصفيحة الدقيقة CARA. باستخدام شريط اللوحة ، قم بربط أكوام من ألواح CARA الدقيقة ، ثم ضعها في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الإغلاق. احتضان الصفائح الدقيقة M. smegmatis CARA عند 37 درجة مئوية مع 20٪ O₂ لمدة يوم إلى يومين لتكرار الألواح ولمدة يومين إلى ثلاثة أيام للألواح غير المتماثلة.

عندما يكون فيلم النمو البكتيري ، أو المستعمرات العيانية الأكبر مرئيا في آبار التحكم السلبية ، استخدم مجموعة واحدة من 12 طرف P200 مع ماصة متعددة القنوات لتوزيع 40 ميكرولترا من PBS المعقمة على طول جانب الآبار ، والسماح ل PBS بالتوزيع عبر الجزء العلوي من المستعمرات الدقيقة البكتيرية في الأجار.

قم بإعداد كاشف CARA النامي عن طريق خلط 5 ملليغرام من الريزازورين و 50 مل من 5٪ Tween-80 في PBS. أضف 50 ميكرولترا من كاشف CARA المحضر حديثا إلى كل بئر من صفيحة CARA. بعد ذلك ، قم بهز الصفائح ذهابا وإيابا عدة مرات للمساعدة في توزيع الكاشف عبر الأجار والحصيرة البكتيرية في كل بئر. ضع الألواح في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الغلق ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل من أجل M. smegmatis.

قبل قراءة التألق ، ضع ألواح CARA الدقيقة في شفاط السلامة الحيوية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إزالة الأغطية. عند استخدام مقاييس الطيف الضوئي BSL3 خارج خزانة السلامة الحيوية ، قم بلصق ملصق PCR بجودة بصرية فوق اللوحة ، واستخدم منشفة ورقية ناعمة لإغلاقها بإحكام عن طريق الضغط برفق على سطح الملصق. حدد التألق عبر القراءة العلوية مع الإثارة عند 530 نانومتر والانبعاث عند 590 نانومتر.