طريقة في المختبر لتحديد النشاط المضاد لموت الخلايا المبرمج للأجسام المضادة ضد TNFα

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على الخلايا الليفية الفئرانية في الوسائط المحرومة من المصل. أضف التخفيفات التسلسلية للأجسام المضادة الخاصة ب TNFα.

أضف TNFα — السيتوكين الالتهابي.

حضن. يحفز الحرمان من المصل الإجهاد الخلوي ، مما يجعل الخلايا عرضة لموت الخلايا المبرمج بوساطة TNFα.

يؤدي

ارتباط TNFα بمستقبلاته على الخلايا المحرومة من المصل إلى شلالات إشارات داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى تنشيط سلسلة الكاسباز وتحفيز موت الخلايا المبرمج.

ومع ذلك ، فإن ارتباط الجسم المضاد ب TNFα يمنع ارتباط مستقبلاته ، مما يمنع تنشيط الكاسباز.

بعد الحضانة ، أضف خليط كاشف يحتوي على منظف ، وركيزة كاسباز متلألئة ، وإنزيم لوسيفيراز جنبا إلى جنب مع أيونات ATP والمغنيسيوم. امزج واحتضن.

يتخلل المنظف الأغشية ، ويطلق الكاسباسات من الخلايا التي يسببها TNFα.

تحتوي

الركيزة المضيئة بيولوجيا على موقع التعرف على الكاسباز. يشق الكاسباسات المحددة الركيزة ، مما ينتج عنه أمينولوسيفيرين.

يؤكسد لوسيفيراز ركيزته ، أمينولوسيفيرين ، مما يؤدي إلى انبعاث الضوء.

قياس شدة التلألؤ للكشف عن انخفاض التلألؤ مع زيادة تركيزات الأجسام المضادة ، مما يشير إلى فاعلية الأجسام المضادة الخاصة ب TNFα لتحييد TNFα ومنع موت الخلايا المبرمج الناجم عن TNFα.

أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى 60 بئرا داخليا للوحة الفحص ، بدءا من العمود 2 إلى 11. امزج تعليق الخلية عن طريق سحب العينة لإضافة حصص إلى الصفيحة الدقيقة. على الفور ، انقل 50 ميكرولترا من التخفيفات المعينة إلى لوحة الفحص.

بالنسبة للممرات المتوازية، قم بتوزيع التخفيفات عن طريق تدوير الماصة الدقيقة. يمكن توزيع التخفيفات المعينة في الآبار بالترتيب التالي. يتم توزيع الضوابط في الآبار المحيطة.

خفف TNF-alpha ب 500 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. امزج بواسطة خلاط دوامة بسرعة 2,200 دورة في الدقيقة. انقله إلى أنبوب سعة 15 مل ، وأخيرا ، خفف إلى 40 نانوجرام لكل مل باستخدام وسط ثقافة الفحص. قم بتوزيع 50 ميكرولترا من محلول تحريض موت الخلايا المبرمج في 60 بئرا داخليا خارجيا. قم بتوزيع ميكرولتر من محلول تحريض موت الخلايا المبرمج في 60 بئرا داخليا للفحص. أخيرا ، احتضن لمدة 16 ساعة.

في اليوم الخامس ، أعد تكوين الركيزة بمحلول العازلة الخاص بها وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. امزج عن طريق التقليب خمس مرات. استغن عن محلول الركيزة ، وأضف 50 ميكرولترا من محلول الركيزة إلى كل عينة جيدا في لوحة الفحص. أيضا ، أضف الركيزة إلى عناصر التحكم. حرك الاختبار في خلاط دوامة بسرعة 400 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق.

أخرج لوحة الفحص من الخلاط واحتضانها في درجة حرارة الغرفة. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي لقارئ الألواح. افتح برنامج Softmax Pro أو أي برنامج مكافئ. قم بتحميل الصفيحة الدقيقة في مقياس الطيف الضوئي واضبط المعلمات التالية.

قم بتنشيط وظيفة التلألؤ على نوع الحفارة في وظيفة نقطة النهاية. اضبط منطقة الحفارة باستثناء العمودين 1 و 12. حدد نوع اللوحة إلى صفيحة سفلية شفافة قياسية ذات 96 بئرا. قم بتغيير وقت التكامل حتى 1250 مللي ثانية. اضبط وقت الاهتزاز للصفيحة الدقيقة على 10 ثوان. حدد الجدار الذي سيتم فيه وضع المادة المرجعية والمادة التحليلية وعينة التحكم. ابدأ في القراءة.