اختبار الخلايا المتغصنة النبضية باللقاح للحث على تكاثر الخلايا الليمفاوية

ابدأ بإضافة مستضدات لقاح الاختبار إلى مزرعة الخلايا المتغصنة.

تتعرف الخلية المتغصنة على المستضد ، وتستوعبه عن طريق الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات ، وتجزئها إلى ببتيدات أصغر ، وتنقل مركب مستضد معقد التوافق النسيجي الكبير الناتج إلى سطح الخلية للعرض.

الزراعة المشتركة للخلايا المتغصنة العارضة للمستضد مع الخلايا الليمفاوية التائية الساذجة لتمكين التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية ومركب مستضد معقد التوافق النسيجي الكبير ، جنبا إلى جنب مع مستقبلاتها المشتركة.

هذا يؤدي إلى تكوين المشبك المناعي ، وتنشيط الخلايا الليمفاوية التائية عبر الإشارات داخل الخلايا.

الخلايا الليمفاوية التائية المنشطة لتمدد نسيلي ، مما ينتج عنه الخلايا الليمفاوية التائية المستجيبة.

أضف جزيئات السيتوكين إنترلوكين 2 أو IL-2 إلى الثقافة واحتضنها. يؤدي ارتباط IL-2 إلى إرسال إشارات داخل الخلايا ، مما يتيح تكاثر الخلايا الليمفاوية وبقائها.

خذ كمية صغيرة من الثقافة وأجهزة الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية بالخلايا المتغصنة العارضة للمستضد وانقلها إلى نفس البئر.

تؤدي إعادة التحفيز بالمستضد إلى زيادة تكاثر الخلايا الليمفاوية.

إجراء تحليل المصب لتحديد علامات محددة مرتبطة بانتشار الخلايا الليمفاوية.

لتوليد MoDCs النبضية بالمستضد ، أضف 1 ميكرولتر لكل مليلتر من لقاح فيروس داء أو تعليق RV إلى 1 مليلتر من ثقافة MoDC الساذجة في اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واحتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. في اليوم السابع ، احتفظ بالصفيحة المكونة من 24 بئرا التي تحتوي على MoDCs النبضية بالمستضد على الجليد لمدة 10 دقائق قبل إضافة 1 مليلتر من PBS المثلج المثلج لكل بئر ، وخلطها جيدا. انقل التعليق إلى أنبوب سعة 15 مل.

اغسل الآبار ب 2 مل من PBS المثلج. اجمع الخلايا المتبقية داخل كل بئر ، وانقل المحتويات المغسولة إلى الأنابيب الخاصة بها. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 جم لمدة 7 دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق حبيبات خلية MoDCs النبضية بالمستضد في وسط ثقافة كامل لضبط التركيز النهائي البالغ 100,000 خلية لكل مليلتر.

بالنسبة للزراعة المشتركة للخلايا الليمفاوية في وزارة الدفاع ، قم بزرع آبار صفيحة معقمة مكونة من 24 بئرا مع 1 مليلتر من تعليق الخلايا الليمفاوية الساذجة و 1 مليلتر من تعليق MoDC النبضي بالمستضد أو غير النبضي بالمستضد في اليوم السابع من نبضة المستضد. بعد يومين من الحضانة ، استكمل كل بئر ب 20 نانوغرام لكل مليلتر من الإنترلوكين المؤتلف -2 ، واستمر في الحضانة لمدة 120 ساعة أخرى.

في اليوم 14 ، قم بنقل 1 مليلتر من الثقافة المشتركة إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مليلتر ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب. ثم, أعد تعليق حبيبات الخلية مع 1 ملليلتر من MoDCs النبضية أو غير النبضية. تخلط جيدا ، وتنقل معلقات الخلية إلى الآبار المقابلة لها.

بعد تلطيخ سطح الخلية ل PBMCs والخلايا الليمفاوية الساذجة والخلايا الوحيدة ، انقل 1 مليلتر من تعليق الخلية إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مليلتر باستخدام ماصة ، وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 500 جم. ثم قم بإعادة تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من PBS ونقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر. أيضا ، اجمع الخلايا المتبقية والأنابيب المقابلة باستخدام 1 مليلتر من PBS. ثم أضف 10 ملليلتر من PBS إلى أنبوب سعة 15 مليلتر الذي يحتوي على الخلايا ، واخلطه عن طريق سحب العينات.

بعد الطرد المركزي للأنبوب لمدة 7 دقائق عند 850 جم ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية بعناية مع التعليق المتبقي المتبقي بعد صب المادة الطافية. انقل تعليق الخلية إلى صفيحة 96 بئر على شكل حرف V ، وأغلق الآبار لتجنب الانسكاب.

بمجرد اكتمال التلوين ، قم بإجراء تحليل مقياس التدفق الخلوي. من المعاينة في الوقت الفعلي ، اضبط عتبة التألق بما في ذلك الجهد والكسب وحجم الخلية لرسم بوابات في النهاية حول مجموعة الخلايا المطلوبة مع استبعاد أي حطام خلوي.