تقنية تلطيخ Tetramer الببتيد-MHC-I لتحليل خلايا ذاكرة CD8+ الخاصة ب SIV
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 4:25 د • July 8th, 2025
خذ خلايا أحادية النواة أحادية النواة للدم المحيطي من الرئيسيات غير البشرية ، أو PBMCs ، التي تحتوي على خلايا الذاكرة التائية CD8 + ضد فيروس نقص المناعة السيميان أو SIV.
أضف مثبط بروتين كيناز لمنع استيعاب مستقبلات الخلايا التائية ، أو TCR عند التحفيز اللاحق.
إدخال مركب التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى ، أو رباعي معقد التوافق النسيجي الكبير ، أو رباعي التوافق النسيجي الكبير ، والمجمعات المترافقة بالفلوروفور التي تتكون من أربعة جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير المرتبطة بالببتيدات الخاصة ب SIV. ترتبط هذه الببتيدات ب TCRs على سطح الخلايا التائية.
أضف خليطا يحتوي على أجسام مضادة مترافقة بالفلوروفور مرتبطة ب CD8 و CD28 و CCR7 - علامات تحدد مجموعات الذاكرة الفرعية للخلايا التائية - والأجسام المضادة التي تصنف الخلايا غير CD8 +.
صبغة الفلورسنت القابلة للحياة تصنف الخلايا الميتة.
إصلاح الخلايا. تغلغل عليها للوصول إلى الأهداف داخل الخلايا.
أضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور المرتبطة ب CD3 ، وعلامة الخلايا التائية ، و granzyme B داخل الخلايا ، وهي علامة خلية CD8 + T نشطة.
باستخدام قياس التدفق الخلوي ، استبعد الخلايا التائية غير CD8 + والخلايا الميتة.
بوابة pMHC-I الخلايا التائية الإيجابية CD8 + T لتوصيف مجموعات فرعية مختلفة من خلايا الذاكرة CD8 + T بناء على مستويات الجرانزيم B و CD28 و CCR7.
ابدأ بإعادة تعليق Rhesus PBMCs في وسط R-10 عند 1.6 في 10 إلى الخلايا السابعة لكل تركيز مليلتر. Aliquot 50 ميكرولترا من الخلايا إلى العدد المناسب من أنابيب قياس التدفق الخلوي ، وأضف 50 ميكرولترا من مثبط بروتين كيناز إلى كل أنبوب. دوامة كل أنبوب ، واحتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
يجب تخفيف الكمية الصحيحة من رباعي الببتيد MHC المعير بدرجة كافية من المزيج الرئيسي لتلطيخ جميع الأنابيب التجريبية. لذلك، من المهم تحضير فائض بنسبة 15٪ من المزيج الرئيسي لحساب أخطاء سحب العينات.
أثناء احتضان الخلايا ، قم بتكبيل مجاميع البروتين ومحلول رباعي عن طريق الطرد المركزي لتقليل تلطيخ الخلفية. بعد ذلك ، قم بتخفيف رباعيات التركيبات في ما يكفي من المخزن المؤقت للبقع بحيث يمكن إضافة 25 ميكرولترا من مزيج رباعي الترامير الرئيسي إلى كل أنبوب قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك ، قم بدوامة أنابيب العينة ، واحتضان محاليل رباعي PBMC في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. في نهاية الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من ماستر التلوين إلى أنابيب العينة المناسبة ، واخلط الأنابيب عن طريق الدوامة.
بعد 25 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الخلايا بمحلول غسيل ، وقم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وصب المادة الطافية بعناية دون إزعاج الكريات. دوامة الخلايا في المخزن المؤقت المتبقي في كل أنبوب ، وقم بإصلاح العينات ب 250 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهايد لكل أنبوب. دوامة على الفور واحتضان الأنابيب في الظلام عند 4 درجات مئوية. بعد 20 دقيقة ، اغسل الخلايا في محلول غسيل طازج ، وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وصب المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية ، والدوامة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام. ثم اغسل الخلايا وحبيبها. ثم ، صب المواد الطافية ، كما هو موضح سابقا. انتقل إلى إضافة 50 ميكرولترا من مزيج البقع الرئيسي داخل الخلايا إلى الأنابيب المناسبة. دوامة كل عينة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد الانتهاء من الحضانة ، اغسل الخلايا وحبيبها. العينات جاهزة الآن للحصول عليها في مقياس التدفق الخلوي.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لتوصيف مجموعات الخلايا التائية الذاكرة CD8 + في الرئيسيات غير البشرية باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتضمن البروتوكول استخدام رباعيات pMHC-I وأجسام مضادة متنوعة لتحديد وتحليل مجموعات الخلايا التائية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
- قياس التدفق الخلوي
خلفية علمية
- تلعب خلايا CD8 + T دوراً حاسماً في الاستجابة المناعية ضد العدوى الفيروسية.
- يمكن أن يوفر فهم المجموعات الفرعية لذاكرة الخلايا T رؤى قيمة حول تطوير اللقاحات والعلاج المناعي.
- يُعد قياس التدفق الخلوي أداة قوية لتحليل المجموعات الخلوية بناءً على المؤشرات السطحية وداخل الخلوية.
- تُعتبر رباعيات pMHC-I ضرورية لتحديد الخلايا T النوعية للمستضد.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لعزل وتوصيف خلايا T الذاكرة CD8 + من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) للقردة غير البشرية.
- تقييم حالة تنشيط خلايا T باستخدام granzyme B وعلامات أخرى.
- تعزيز فهم استجابات خلايا T لفيروس نقص المناعة القردي (SIV).
الطرق المستخدمة
- عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) من الرئيسيات غير البشرية.
- استخدام مثبطات بروتين كيناز لمنع استدخال مستقبل الخلايا التائية (TCR).
- التصبغ باستخدام رباعيات pMHC-I والأجسام المضادة المقترنة بالفلوروفور.
- تحليل قياس التدفق الخلوي لتوصيف المجموعات الفرعية للخلايا التائية.
النتائج الرئيسية
- التعرف الناجح على المجموعات الفرعية لخلايا T الذاكرة CD8 + بناءً على مستويات granzyme B وCD28 وCCR7.
- إثبات فعالية رباعيات pMHC-I في عزل خلايا T النوعية لفيروس SIV.
- تقديم بروتوكول مفصل للدراسات المستقبلية حول استجابات خلايا T.
- تسليط الضوء على أهمية الضوابط المناسبة وتقنيات الصبغ في قياس التدفق الخلوي.
الاستنتاجات
- يعد البروتوكول المطور أداة قيمة لدراسة مناعة الخلايا T في الرئيسيات غير البشرية.
- يمكن للمعلومات المكتسبة من هذه الدراسة أن تساهم في صياغة استراتيجيات اللقاحات ضد SIV والفيروسات ذات الصلة.
- هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لاستكشاف الآثار الوظيفية لمجموعات الخلايا T المحددة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعد التحديد الدقيق والتوصيف للخلايا التائية الذاكرة CD8+ النوعية للمستضد أمراً بالغ الأهمية لتقليل المخاطر المتعلقة بالأهداف المناعية وتوجيه استراتيجيات اللقاحات والعلاج المناعي في النماذج قبل السريرية. تتيح تقنية صبغ رباعيات الببتيد-MHC-I التكميم والتنميط الظاهري عالي الثقة لمجموعات الخلايا التائية النوعية لـ SIV، مما يدعم المراقبة المناعية التنبؤية والاستمرارية الانتقالية. تعزز هذه القدرة سير عمل الاكتشاف المبكر والتحقق من الأهداف لمحافظ الأمراض المعدية والأورام المناعية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يسمح بالاستقصاء المباشر لاستجابات الخلايا التائية النوعية للمستضد في نماذج الرئيسيات غير البشرية.
- يدعم التحقق الوظيفي من الهدف من خلال التمييز بين حالات الذاكرة والتنشيط عبر المؤشرات السطحية والداخل خلوية.
- يسهل الحد من المخاطر الميكانيكية عن طريق التحديد الكمي للمجموعات الفرعية من الخلايا التائية CD8+ النوعية لفيروس SIV.
- يعزز الثقة التنبؤية في اختيار الأهداف المناعية وتحديد أولوياتها.
الفحص وتطوير المقايسة
- تأسيس مقايسات تدفق خلوي مصادق عليها للكشف القابل للتكرار عن الخلايا التائية النوعية للمستضد.
- توحيد استراتيجيات تحديد البوابات (gating strategies) ومجموعات المؤشرات لتحليل المجموعات الفرعية للخلايا التائية الذاكرة.
- تمكين القراءات الكمية والمتعددة لعمليات فحص المركبات أو اللقاحات اللاحقة.
- توفير بروتوكولات قابلة للتطوير يمكن تكييفها مع أنظمة مستضدات ونماذج أمراض أخرى.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يوحد نقاط النهاية الخاصة بالمراقبة المناعية بين نماذج الرئيسيات غير البشرية والدراسات الانتقالية البشرية.
- يدعم التقييم القائم على المؤشرات الحيوية لفعالية اللقاحات أو العلاجات في الإعدادات قبل السريرية.
- يتيح اتخاذ قرارات تطوير معدلة حسب المخاطر بناءً على الارتباطات المناعية الكمية.
- يسهل الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري للأصول التي تستهدف الجهاز المناعي.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل طريقة قياس التدفق الخلوي القائمة على الرباعيات هذه ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، مما يربط بين التحقق المبكر من الأهداف المناعية وتطوير المؤشرات الحيوية الانتقالية.
- بيولوجيا الاكتشاف: توفر أدوات قوية لاختبار الفرضيات وتوضيح الآليات الخاصة بالمناعة التي تتوسطها الخلايا التائية.
- الفحص: تقدم مخرجات كمية وقابلة للتكرار لتحديد خصائص الخلايا المناعية وجاهزية المقايسة.
- التحليلات: تتيح المقارنة الإحصائية لترددات المجموعات الفرعية للخلايا التائية الذاكرة وعلامات التنشيط عبر الظروف التجريبية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تدعم مواءمة استراتيجيات المراقبة المناعية بين النماذج الحيوانية والدراسات السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتحليل الخلايا التائية المتخصصة بالمستضد عبر برامج بحثية متنوعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الأهداف المناعية وتقلل من الغموض الآلي.
- القيمة التشغيلية: تعزز توحيد المقايسات، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع في سير عمل المراقبة المناعية.
- القيمة الاستراتيجية: تسترشد بها قرارات المضي قدماً أو التوقف، وتعزز كفاءة رأس المال من خلال تمكين التخفيف المبكر من المخاطر المناعية.
- التأثير على المحفظة: تدعم ترتيب الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بالأصول المناعية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في قياس التدفق الخلوي والتنميط المناعي.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة قياس التدفق الخلوي متعددة المعلمات ولوحات أجسام مضادة مُعتمدة.
- يقتضي توحيداً دقيقاً بين الفرق لبروتوكولات تحديد البوابات (gating) والتلوين.
- قابل للتكيف مع أنظمة مستضدات متنوعة، ولكنه يعتمد على توفر رباعيات pMHC محددة.
- تشمل القيود المحتملة التلوين الخلفي والحاجة إلى اختيار دقيق لمجموعات الضبط.
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الكمي المتزامن ل CD8 لمكافحة ناقلات الأمراض والتحوير-الخاصة بمكافحة+ تي الخلايا عن طريق MHC أنا تيترامير تلطيخ بعد التطعيم مع ناقل فيروسي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل الماوس الكلى المقيم CD8+ الخلايا T لتحليل تدفق cytometry
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
المستضد CD4 + تصور معين باستخدام خلايا T MHC الدرجة الثانية Tetramers
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تقنية لتصور في الوقت نفسه للفيروسات محددة CD8 + الخلايا T والخلايا المصابة بالفيروسات في الموضع
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تحليل قردي نقص المناعة CD8 للفيروسات محددة + خلايا تي في القرد قرود المكاك التي كتبها الببتيد-MHC-I Tetramer تلطيخ
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
كوانتيتيشن خلية واحدة مرناً و "سطح التعبير البروتين" في خلايا CD4 المصابين "فيروس نقص المناعة القردي"+ "تي الخلايا المعزولة" من macaques ريسوس
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 22 أغسطس 2026