تصوير رنين البلازمون السطحي الموضعي للكشف عن إفرازات البروتين من خلية واحدة

ابدأ بشريحة مستشعر زجاجية تتميز بمصفوفات ذهبية نانوية وظيفية مع طبقة أحادية التجميع ذاتية تحتوي على مجموعات كربوكسيل.

قم بتأمين الشريحة داخل مجموعة ميكروفلويديك وأدخل رابطا لتنشيط مجموعات الكربوكسيل.

أضف روابط الببتيد ، مقترنة بمجموعات الكربوكسيل المنشطة عبر الروابط.

عالج بمخزن مؤقت يحتوي على مركب مزيل التنشيط ، وإلغاء تنشيط مواقع الربط غير المحددة ، واغسله بمخزن مؤقت.

ركز ضوءا مستقطبا على الشريحة. باستخدام نظام تصوير رنين البلازمون السطحي الموضعي ، احصل على صورة للمصفوفات - تظهر على شكل مربعات ساطعة على خلفية داكنة.

عند زاوية الرنين ، تمتص إلكترونات الذهب الضوء. قم بقياس شدة الضوء المنعكس بالزاوية المقابلة ، لتوليد استجابة المستشعر.

إدخال خلايا الورم الهجين المفرزة للبروتين ، والتي ترتبط بالرقاقة وغسلها.

تفرز الخلايا المرفقة بروتينات تتفاعل مع الروابط الموجودة على المصفوفة القريبة.

هذه التفاعلات زاوية الضوء المنعكس وشدته ، مما يؤدي إلى تغيير في استجابة المستشعر ، مما يؤكد النشاط الإفرازي للخلايا.

لتنظيف وتجديد رنين البلازمون السطحي الموضعي ، أو رقائق LSPR ، رماد البلازما بقوة 40 واط في خليط 300 مل من 5٪ هيدروجين و 95٪ أرجون لمدة 45 ثانية. قم بتشغيل سطح الذهب والبنى النانوية مباشرة بعد رماد البلازما عن طريق غمر الرقاقة في محلول ثيول إيثانولي مكون من عنصرين يتكون من نسبة 3 إلى 1 من SPO و SPC. بعد ترك الرقاقة في محلول الثيول طوال الليل لتشكيل طبقة أحادية التجميع ذاتيا ، اشطفها بالإيثانول وجففها بغاز النيتروجين.

قم بتحميل شريحة LSPR داخل حامل ميكروسوائل مصنوع خصيصا عن طريق وضع الشريحة على قطعة سفلية من الألومنيوم. بعد ذلك ، ضع الرقاقة بين هذه القطعة السفلية ، وحشية سيليكون ، وقطعة علوية بلاستيكية شفافة باستخدام أربعة براغي لتثبيت التجميع.

بالنسبة لتطبيق الثيول النموذجي القائم على SPC ، قم بإسقاط 300 ميكرولتر من خليط 1 إلى 1 من 133 مللي مولار EDC و 33 مللي مولار NHS في الماء المقطر منزوع الأيونات لتنشيط مجموعات الكربوكسيل لمكون SPC thiol. بعد الانتظار لمدة 10 دقائق ، اشطف السطح يدويا باستخدام 10 مللي مولار PBS.

بعد ذلك ، قم بتجميع مجموعة الكربوكسيل المنشط مع الترابط محل الاهتمام عن طريق طلاء 300 ميكرولتر من محلول الترابط. بعد الانتظار لمدة ساعة واحدة وشطف السطح ب 10 مللي مولار PBS ، قم بإسقاط 300 ميكرولتر من 0.1 مولار إيثانول أمين في PBS على الرقاقة لتقليل الارتباط غير المحدد. بعد الانتظار لمدة 10 دقائق ، اغسل الإيثانول أمين باستخدام PBS ، الذي يحتوي على 0.005٪ Tween 20 أو PBS-T20.

بعد ذلك ، ضع قطعة كوارتز فوق الرقاقة لتقليل التقلبات في البيانات المتعلقة بتغيير الغضروف المفصلي. حافظ على الشريحة مبللة باستخدام المخزن المؤقت PBS-T20 أثناء التركيب على المجهر. قم بتوصيل أنبوب الموائع الدقيقة بالتجميع ومخزن التدفق المؤقت حتى يتم الوصول إلى حالة مستقرة. بعد ذلك ، ضع مجموعة طرف LSPR بإحكام في حامل عينة المرحلة المسخنة.

الإعداد البصري لهذه الطريقة هنا. يتم تمرير الضوء من مصباح الهالوجين عبر مرشح تمرير بطول 593 نانومتر للتخلص من الأطوال الموجية التي لا تساهم في الاستجابة النانوبلازمونية. ثم يتم استقطاب الضوء خطيا ، ويتم إضاءة العينة ، عبر هدف فتحة عددية 40 × 1.4 لإثارة الهياكل النانوية الذهبية البلازمونية. يتم جمع الضوء المتناثر بواسطة الهدف ، ويمر عبر مستقطب متقاطع لتقليل إشارة الخلفية من الركيزة الزجاجية. يتم إدخال مقسم شعاع 50/50 في مسار الضوء الذي تم جمعه لتحليل طيفي وصور متزامن.

بعد السماح للتجميع والمجهر بالتوازن لمدة ساعتين على الأقل ، قم بمحاذاة الشريحة باستخدام عصا التحكم بحيث تتم محاذاة المصفوفة المركزية مع الألياف البصرية للتحليل الطيفي. بعد زراعة خلايا الورم الهجين وتكويرها عن طريق الطرد المركزي ، قم بحصادها. بعد ذلك ، اختبر قابليتها للتطبيق قبل إدخالها على رقائق LSPR. بعد ذلك ، أدخل 50 ميكرولترا من محلول الخلية يدويا على رقائق LSPR باستخدام ماصة دقيقة. أخيرا ، اغسل الخلايا المتبقية في المحلول بوسائط جديدة خالية من المصل باستخدام نظام نضح الموائع الدقيقة لتحضير رقائق LSPR للتصوير.