القياس الكمي لنشاط عزل البلغم الذاتي السائب في خلايا الثدييات

يتضمن الالتهام الذاتي السائب عزل البضائع الذاتية والبروتينات العصارية الخلوية القابلة للذوبان ، بما في ذلك نازعة هيدروجين اللاكتات أو LDH ، داخل الجسيمات الذاتية للتحلل.

لتقييم عزل LDH ، الذي يعكس نشاط البلع الذاتي السائب ، خذ كوفيت التثقيب الكهربائي مع الخلايا المتعطشة للمغذيات المعالجة بمثبطات لمنع التحلل الذاتي الليزوزومي.

قم بإجراء التثقيب الكهربائي لتعطيل غشاء الخلية بشكل انتقائي وإطلاق البروتينات القابلة للذوبان.

امزج الخلية المعطلة بمحلول السكروز المخزن للحفاظ على المكونات الخلوية.

انقل محلول التعطيل المخفف المطلوب إلى أنبوب يحتوي على مخزن مؤقت. جهاز طرد مركزي لفصل LDH غير المعزول عن LDH المعزول بالبلعمة الذاتية.

انقل المحلول التعطيلي المخفف المتبقي ، الذي يحتوي على جزء LDH الخلوي الكلي ، إلى أنبوب آخر.

أضف عازلة غير أيونية تحتوي على خافض للتوتر السطحي إلى كلا الأنبوبين لاستخراج كسور LDH المعزولة والكلي.

أجهزة الطرد المركزي ونقل المواد الطافية المحتوية على LDH إلى أنابيب تحتوي على عازلة مع البيروفات و NADH.

يحول LDH البيروفات إلى لاكتات مع أكسدة NADH ، مما يقلل من مستويات NADH المرتبطة بتركيز LDH.

تحديد LDH في الكسور الخلوية المترسب والكلية لتحديد عزل LDH.

باستخدام ماصة ، أعد تعليق حبيبات الخلية للحصول على تعليق قريب من خلية واحدة. انقل هذا التعليق إلى كوفيت كهربائي 4 ملم. ضع الكوفيت في مثقب كهربائي لموجة الاضمحلال الأسية وقم بتفريغ نبضة كهربائية واحدة عند 800 فولت و 25 ميكروفاراد و 400 أوم.

استخدم طرف ماصة جديد لنقل الخلية التي تعطلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مقاس 1.5 ملم يحتوي على 400 ميكرولتر من محلول السكروز المخزن بالفوسفات المثلج، واخلطه لفترة وجيزة عن طريق سحب العينات. كرر عملية إعادة التعليق وتعطيل القطب الكهربائي والخلط لكل عينة. في حالة تنفيذ الإجراء لأول مرة ، تأكد من التحقق من تعطيل قطب غشاء البلازما الفعال والانتقائي كما هو موضح في النص.

للحصول على كسور LDH المترسبة ، قم بإزالة 550 ميكرولتر من كل محلول مخفف معطل بالخلايا ، وانقله إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 ملليلتر الخاص به الذي يحتوي على 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق المثلج مع 0.5٪ BSA و 0.01٪ Tween-20. الماصة لفترة وجيزة للخلط. جهاز طرد مركزي عند 18,000 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة لإنتاج كريات تحتوي على LDH مرسوب. باستخدام الشفط ، قم بشفط المادة الطافية جيدا لترك الكريات جافة قدر الإمكان.

قم بتخزين عينات LDH المترسبة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للتحليل. بالنسبة لإجمالي كسور LDH ، انقل 150 ميكرولترا من كل محاليل من المحاليل المخففة المعطلة بالخلايا إلى الأنبوب الجديد الخاص بها. قم بتخزينها في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للتحليل.

قم بإذابة كل من LDH المترسب وإجمالي عينات LDH على الجليد. بمجرد إذابته ، أضف 300 ميكرولتر من محلول إعادة التعليق المثلج البارد الذي يحتوي على 1.5٪ Triton X-405 إلى إجمالي عينات LDH. قم بتدوير العينات على أسطوانة في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 750 ميكرولترا من المخزن المؤقت لإعادة التعليق المثلج البارد الذي يحتوي على 1٪ Triton X-405 إلى عينات LDH المترسبة. استخدم ماصة لإعادة تعليق الكريات حتى يصبح المحلول متجانسا. الطرد المركزي جميع العينات عند 18,000 مرة جم في 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق لترسيب الحطام الخلوي غير المذاب.

بعد اكتمال الطرد المركزي ، ضع العينات على الجليد. تحديد مستويات LDH في المواد الطافية باستخدام إما اختبار إنزيمي كلاسيكي كما هو موضح في النص أو أي من مجموعة متنوعة من المجموعات المتاحة تجاريا.