اختبار تشكيل التركيز لقياس عيار الفيروس في أعضاء الفأر المصاب

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على طبقة أحادية من خلايا الثدييات.

تلقيح الآبار بالتخفيفات التسلسلية لمجانسات الأنسجة التي تحتوي على فيروس زيكا المشتق من أعضاء مختلفة من الفأر المصاب.

عند دخوله إلى الخلايا عن طريق الالتقام الخلوي ، يتكاثر الفيروس وينطلق ليصيب الخلايا المجاورة.

تراكب بمحلول ميثيل سلولوز عالي اللزوجة ، مما يخلق حاجزا ماديا يقيد حركة الفيروس.

يسمح الحاجز فقط بإصابة الخلايا المجاورة مباشرة ، وتشكيل بؤر الخلايا المصابة ، ويضمن أن كل تركيز ينشأ من جسيم فيروس واحد ، مما يتيح القياس الكمي بدقة.

إصلاح الخلايا واختراق الغشاء. أضف الأجسام المضادة الأولية التي تدخل الخلايا وتتفاعل مع المستضد الفيروسي.

إدخال جسم مضاد ثانوي مترافق بالبيروكسيداز يرتبط بالجسم المضاد الأساسي.

أضف ركيزة كروموجينيك يتم تحويلها بواسطة البيروكسيديز لإنشاء بقع ملونة ، مما يشير إلى بؤر الخلايا المصابة.

عد البؤر لتحديد عيار الفيروس في أعضاء الفأر المختلفة.

قم بإزالة العينات المتجانسة من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر واتركها تذوب. مع وضع العينات على الجليد، قم بتخفيف فيروس زيكا 10 أضعاف في البئر الأول من لوحة التخفيف، واستخدم ماصة متعددة القنوات لإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف أسفل اللوحة، وتغيير الأطراف في كل مرة عن طريق إضافة 20 ميكرولترا من العينة إلى 180 ميكرولترا من وسائط النمو.

قم بتغيير أطراف الماصة بين كل مخفف. قم بإعداد لوحة تشكيل التركيز عن طريق إزالة الوسائط من اللوحة المسطحة القاع المعدة المكونة من 96 بئرا والتي تغطي خلايا Vero. لمنع جفاف الطبقة الأحادية ، أضف على الفور 100 ميكرولتر من تخفيف الفيروس إلى كل بئر في لوحة Vero. استخدم نفس مجموعة النصائح للإضافة من أدنى إلى أعلى تركيز.

صفائح الصخور جنبا إلى جنب من 2 إلى 4 مرات ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إلى ساعتين. قم بتسخين 2٪ ميثيل السليلوز إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول ميثيل السليلوز بنسبة 2٪ في وسط النمو بنسبة 2 إلى 1 تقريبا. بعد الحضانة ، أضف 125 ميكرولترا من وسائط نمو ميثيل السليلوز إلى كل بئر من الألواح المكونة من 96 بئرا. احتضن مرة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 32 إلى 40 ساعة.

لإصلاح خلايا Vero ، في خزانة السلامة الحيوية ، أضف 50 ميكرولترا من 5٪ بارافورمالدهيد فوق الجزء العلوي من طبقة ميثيل السليلوز في كل بئر من الألواح المكونة من 96 بئرا. احتضن لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك ، قم بتغطية الأطباق بالبارافيلم ، وضعها على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.

بعد ذلك ، استخدم ماصة لإزالة التراكب والوسائط من الخلايا في حاوية يمكن التخلص منها داخل خزانة السلامة الحيوية. يغسل برفق مع 150 ميكرولتر من PBS لكل بئر. قم بإزالة PBS من الألواح وإزالة اللوحة من خزانة السلامة الحيوية. كرر غسل PBS مرتين. ثم أضف 150 ميكرولترا لكل بئر مرة واحدة من المخزن المؤقت للغسيل FFA واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 إلى 10 دقائق لاختراق الخلايا الثابتة.

بعد ذلك ، استخدم الجسم المضاد لزيكا الأساسي للكشف عن العدوى. تحضير الجسم المضاد الأساسي 4G2 بتركيز 1 ميكروغرام لكل مليلتر في مخزن تلطيخ FFA. قم بنفض الغبار عن المخزن المؤقت للغسيل FFA من الألواح ، وأضف 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الأساسي في مخزن تلطيخ FFA إلى كل بئر. بعد ذلك ، أغلق الألواح بغشاء بلاستيكي أو فيلم بلاستيكي ، واحتضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

قم بإعداد الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر المسمى HRP بتركيز 1 إلى 5,000 في مخزن تلطيخ FFA. بعد إزالة محلول الجسم المضاد ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 150 ميكرولتر من محلول الغسيل FFA لكل بئر. قم بإزالة مخزن الغسيل عن طريق النقر في الحوض في كل مرة.

قم

بتلطيخ الخلايا بالجسم المضاد الثانوي في مخزن تلطيخ FFA عند 50 ميكرولتر لكل بئر ، واحتضان ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام مخزن غسيل FFA مرة أخرى ، وقم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل عن طريق النقر في الحوض في كل مرة.

أضف 50 ميكرولترا من ركيزة Trueblue إلى كل بئر. انتظر من 2 إلى 15 دقيقة حتى يتم تحديد البقع بالكامل بأقل قدر من الخلفية. بعد أن تظهر البقع ، اغسل برفق بالماء باستخدام يد لحماية الطبقة الأحادية من قوة جريان الماء. يجفف بالصنبور على مناشف ورقية.

بعد فترة وجيزة ، استخدم نطاق تشريح لحساب البقع يدويا في كل بئر أو استخدم عداد موضعي آلي. في برنامج الالتقاط المناعي ، حدد مخففا ببؤر مميزة بسهولة بين 20 إلى 200 لكل بئر لكل عينة ، واحسب العيار بوحدات تشكيل التركيز لكل مليلتر باستخدام متوسط الآبار المكررة.