اختبار في المختبر لتحديد نمو الطفيليات داخل الخلايا في البلاعم

خذ صفيحتين دقيقيتين يحتويان على أغطية مع ضامة مشتقة من نخاع العظام أو BMMs.

أضف البروماستيجوت الحلقي ليشمانيا - المرحلة السوطية الممدودة - في صفيحة واحدة وأماستيجوتس - المرحلة البيضاوية غير السوطية - في طبق آخر.

أثناء الحضانة ، ترتبط الطفيليات بمستقبلات البلاعم ، مما يؤدي إلى البلعمة بوساطة المستقبلات.

يندمج البلعمة مع الجسيمات الحالة والحويصلات المشتقة من الشبكة الإندوبلازمية وجهاز جولجي ، وينضج في فجوة طفيلية.

يؤدي

انخفاض درجة الحموضة في الفجوة إلى تمايز البروماستيجوت إلى amastigote وتكراره.

يغسل لإزالة الطفيليات غير الداخلية.

قم بإصلاح البلاعم المصابة وإضافة المنظفات لنفاذية الخلايا والطفيليات.

أدخل صبغة الحمض النووي الفلورية لتلطيخ نواة البلاعم والطفيليات.

قم بتركيب الطبقات على الشرائح وراقب تحت المجهر الفلوري ، وحدد النوى المضيفة الأكبر ونواة amastigote الأصغر المحيطة.

قارن بين أرقام amastigotes لتقييم تكاثرها داخل البلاعم المصابة في البداية ببروماستيجوت غير متمايزة مقابل تلك المصابة ب amastigotes التكاثري.

لإصابة الخلايا ب L. Amazonensis ، قم بتخفيف معلق الطفيلي إلى التعدد التجريبي المناسب للعدوى ، وأضف 50 إلى 100 ميكرولتر من الطفيليات إلى كل بئر من جميع الألواح المكونة من 6 آبار ، بما في ذلك جميع النقاط الزمنية للتجربة. احتضان الضامة المشتقة من نخاع العظام لفترة العدوى ودرجة الحرارة المناسبة. بعد ذلك ، اغسل الآبار ثلاث مرات ب 2 ملليلتر من 37 درجة مئوية PBS الطازجة بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم لكل بئر ، وقم بإصلاح عينات النقطة الزمنية الأولية ب 1.5 إلى 2 مل من 2٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق.

بالنسبة للألواح المقابلة للنقاط الزمنية اللاحقة ، أضف 2 مل من وسط البلاعم الطازج المشتق من نخاع العظام إلى كل بئر وأعد الألواح إلى الحاضنة المناسبة. بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا وغسلها لكل نقطة زمنية متبقية كما هو موضح للتو ، وقم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية في PBS الطازج.

لتلطيخ الخلايا ب DAPI ، استبدل المادة الطافية ب 1.5 مل من PBS الطازج بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، مع استكمال منظف غير أيوني بنسبة 0.1٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بثلاث غسلات سعة 2 ملليلتر مع PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا ب 2 ميكروغرام لكل مليلتر من DAPI في 1 مليلتر من PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ثلاث غسلات ، ضع الغطاء على جانب الخلية لأسفل على شرائح مجهر زجاجي فردية مثبتة بكاشف تثبيت مضاد للبهتان متوفر تجاريا. بعد ذلك ، لتحديد عدد الخلايا المصابة ، استخدم هدف زيت الغمر 100x لمجهر التألق وعداد إيمانويل ، لتحديد عدد نوى amastigote الأصغر المتجمعة حول كل نواة ضامة كبيرة ملطخة ب DAPI.