اختبار إطلاق الصبغة لتحديد النشاط الأنزيمي للبروتينات المضادة للميكروبات

ابدأ بأنبوب يحتوي على معلق بكتيري مقتول بالحرارة وعالج بمحلول صبغة.

ترتبط جزيئات الصبغة تساهميا بالببتيدوغليكان - وهو مكون أساسي لجدار الخلية البكتيرية ، مما يضفي لونا أزرق.

بيليه البكتيريا وإزالة المادة الطافية التي تحتوي على جزيئات صبغة غير مرتبطة.

أعد تعليق البكتيريا وأدخل محلول بروتين مضاد للميكروبات في الأنبوب ، مما يؤدي إلى التحلل المائي الأنزيمي للببتيدوغليكان البكتيري ، مما يؤدي إلى تدهور جدار الخلية متبوعا بتحلل الخلية.

هذا يؤدي إلى إطلاق جزيئات الصبغة ، مما يضفي اللون الأزرق.

أضف الإيثانول - عامل تغيير طبيعة البروتين ، مما يؤدي إلى تعطيل البروتينات المضادة للميكروبات وإنهاء التفاعل الأنزيمي.

الطرد المركزي المحتويات لحبيبات شظايا الخلية والإنزيمات. انقل المادة الطافية المحتوية على جزيء الصبغة إلى صفيحة متعددة الآبار.

باستخدام قارئ الألواح ، قم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر.

قارن امتصاص العينة المعالجة بالإنزيم مع امتصاص العينة غير المعالجة بالإنزيم لتحديد النشاط الأنزيمي للبروتين المضاد للميكروبات.

في مقايسة إطلاق الصبغة ، ترتبط الركيزة تساهميا بصبغة Remazol Brilliant Blue R أو RBB. ابدأ هذا البروتوكول بعمل محلول RBB 200 مللي مولار. قم بإذابة 1.25 جرام من المبارين الحمراء في محلول هيدروكسيد الصوديوم الطازج.

بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا البكتيرية المقتولة بالحرارة بتر