اختبار إطلاق الصبغة لتحديد النشاط الأنزيمي للبروتينات المضادة للميكروبات

ابدأ بأنبوب يحتوي على معلق بكتيري مقتول بالحرارة وعالج بمحلول صبغة.

ترتبط جزيئات الصبغة تساهميا بالببتيدوغليكان - وهو مكون أساسي لجدار الخلية البكتيرية ، مما يضفي لونا أزرق.

بيليه البكتيريا وإزالة المادة الطافية التي تحتوي على جزيئات صبغة غير مرتبطة.

أعد تعليق البكتيريا وأدخل محلول بروتين مضاد للميكروبات في الأنبوب ، مما يؤدي إلى التحلل المائي الأنزيمي للببتيدوغليكان البكتيري ، مما يؤدي إلى تدهور جدار الخلية متبوعا بتحلل الخلية.

هذا يؤدي إلى إطلاق جزيئات الصبغة ، مما يضفي اللون الأزرق.

أضف الإيثانول - عامل تغيير طبيعة البروتين ، مما يؤدي إلى تعطيل البروتينات المضادة للميكروبات وإنهاء التفاعل الأنزيمي.

الطرد المركزي المحتويات لحبيبات شظايا الخلية والإنزيمات. انقل المادة الطافية المحتوية على جزيء الصبغة إلى صفيحة متعددة الآبار.

باستخدام قارئ الألواح ، قم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر.

قارن امتصاص العينة المعالجة بالإنزيم مع امتصاص العينة غير المعالجة بالإنزيم لتحديد النشاط الأنزيمي للبروتين المضاد للميكروبات.

في مقايسة إطلاق الصبغة ، ترتبط الركيزة تساهميا بصبغة Remazol Brilliant Blue R أو RBB. ابدأ هذا البروتوكول بعمل محلول RBB 200 مللي مولار. قم بإذابة 1.25 جرام من المبارين الحمراء في محلول هيدروكسيد الصوديوم الطازج.

بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا البكتيرية المقتولة بالحرارة بتركيز 0.5 جرام من الوزن الرطب في 30 مل من محلول RBB. بالنسبة للببتيدوغليكان المنقى ، أعد تعليق الببتيدوغليكان بتركيز 0.3 جرام من الوزن الرطب و 30 مل من محلول RBB.

نظرا لأن الخطوات اللاحقة هي نفسها بغض النظر عن الركيزة المستخدمة ، عرض الملصقات للخلايا البكتيرية فقط. احتضان خليط التفاعل على منصة دوارة لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية مع خلط لطيف. بعد ست ساعات ، انقل خليط التفاعل إلى حاضنة 4 درجات مئوية ، واحتضنه لمدة 12 ساعة إضافية مع الخلط اللطيف.

عند اكتمال الحضانة ، قم بحصاد الركيزة المصبوغة عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 مرة جم لمدة 30 دقيقة. صب محلول الصبغة من بيليه الركيزة. أعد تعليق الحبيبات جيدا في النوع 1 ماء متبوعا بالطرد المركزي. اغسل الخلايا الملصقة بالصبغة ثلاث إلى خمس مرات بهذه الطريقة لإزالة الصبغة القابلة للذوبان غير المرتبطة تساهميا من الركائز.

للغسيل النهائي ، انقل جزء الحبيبات الذي سيتم استخدامه في مقايسة إطلاق الصبغة إلى أنابيب ميكرو فوج سعة 1.5 ملليلتر. يجب أن يكون الطافي في الغسيل الأخير واضحا ، بينما تظل الركيزة زرقاء. قم بتخزين الركيزة المصبوغة المعلقة في كمية قليلة من الماء عند سالب 20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

للتحضير لمقايسة إطلاق الصبغة ، اسمح للركيزة المصبوغة المجمدة بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة ، واغسلها مرتين باستخدام المخزن المؤقت للفحص الذي تم تحديده تجريبيا للإنزيم. يتم استخدام PBS ، في هذه الحالة. احسب حجم تعليق الركيزة المطلوب بضرب حجم تفاعل 200 ميكرولتر في عدد فحوصات إطلاق الصبغة التي سيتم إجراؤها.

لتحضير تعليق الركيزة ، أضف أولا الركيزة المصبوغة إلى الحجم المناسب من PBS. قم بإجراء تخفيف واحد لواحد وقم بإجراء قياس أولي للكثافة الضوئية عند 595 نانومتر باستخدام PBS كفارغ. أضف كميات متزايدة من الركيزة المصبوغة إلى التعليق حتى يتم تحقيق كثافة بصرية تبلغ 2.0 عند 595 نانومتر.

في هذا العرض التوضيحي ، سيتم استخدام مقايسة إطلاق الصبغة لتحديد ظروف الحضانة المثلى لبروتين مضاد للميكروبات. أولا ، قم بإعداد معلق مضاد للميكروبات من البروتين عن طريق ضبط التركيز إلى 1 ملليغرام لكل مليلتر باستخدام PBS ، كما هو موضح في نص البروتوكول. بعد ذلك ، قم بتخفيف معلق البروتين المضاد للميكروبات إلى تركيز 100 نانوجرام لكل ميكرولتر.

يعطي هذا التركيز كتلة تفاعل نهائية تبلغ 1 ميكروغرام من البروتين لكل حجم مضاف إلى تفاعل الفحص. قم بإجراء فحوصات التفاعل في أنابيب الطرد الدقيق سعة 0.5 ملليلتر لتقييم النطاق الحراري. لكل حالة حرارية ، أضف 10 ميكرولتر من بروتين المخزون إلى 200 ميكرولتر من تعليق الركيزة المحضر.

احتضن في جهاز تدوير حراري لمدة ثماني ساعات مع الخلط عن طريق الانعكاس مرة واحدة في الساعة. بعد الحضانة ، أوقف التفاعلات عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من الإيثانول إلى كل أنبوب ميكروفوج. لإزالة الركيزة غير القابلة للذوبان غير المهضومة ، جهاز الطرد المركزي عند 3,000 مرة جم لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، مع الحرص على عدم تعطيل حبيبات الركيزة غير المهضومة ، انقل 150 ميكرولترا من المادة الطافية للتفاعل لكل خليط تفاعل إلى صفيحة دقيقة مسطحة القاع ذات 96 بئرا.

لتحديد النشاط الأنزيمي ، استخدم مقياس الطيف الضوئي الدقيق لقياس امتصاص المادة الطافية عند 595 نانومتر. زيادة الامتصاص بواسطة الصبغة القابلة للذوبان المنبعثة في المادة الطافية من الركيزة المسماة هي قياس كمي للنشاط الأنزيمي.